Die Diagnose von invasiven Pilzinfektionen ist besonders beim immungeschwächten Patienten nach wie vor schwierig. Da die meisten konventionellen Methoden zu wenig sensitiv sind, ist eine Kombination mehrerer Testverfahren nötig, um zu einer Diagnose zu kommen, die mit der gemeinsamen Beurteilung klinischer Parameter und bildgebender Verfahren den Nachweis von invasiven Pilzinfektionen ermöglicht.

Da invasive Pilzinfektionen meist sehr schwer verlaufen und eine relativ hohe Letalität aufweisen können, besteht die berechtigte Forderung nach einer raschen, einfachen und möglichst frühzeitigen Diagnose. Je früher die Diagnose gestellt werden kann, desto besser ist die Prognose für den Patienten. Da kein einziger Test aussagekräftig genug ist, um eine verlässliche Diagnose zu stellen, ist es notwendig eine Kombination von mehreren Parametern zur Diagnosefindung heranzuziehen. Dabei sollen klinische Symptome, bildgebende Verfahren und Ergebnisse der mykologischen Untersuchung gemeinsam beurteilt werden. Auch im mykologischen Laboratorium sollte eine Kombination mehrerer Untersuchungsmethoden eingesetzt werden, um die Aussagekraft der einzelnen Untersuchungen zu erhöhen.1, 2

Diagnostische Techniken zum Nachweis von Mykosen
Histologie
Nach wie vor ist der wichtigste Beweis für die Invasivität des Erregers der histologische Nachweis, eine genaue Erregerbestimmung ist damit jedoch nicht möglich. Da die Beurteilung der sonst üblichen Färbungen bezüglich Pilzinfektionen oft schwierig ist, sollte bei allen Risikopatienten (alle Immunsupprimierte inklusive Patienten unter systemischer Kortikosteroidtherapie) im Rahmen einer histologischen Untersuchung unbedingt eine spezielle Pilzfärbung (z.B. PAS-Färbung oder Färbung mit Methenamin-Silbernitrat) angefordert werden.2

Mikroskopie
Mikroskopische Untersuchungsverfahren sind rascher und vielfach sensitiver als die Kultur, sodass bei jeder mykologischen Untersuchung unbedingt auch eine mikroskopische Beurteilung des Untersuchungsmaterials durchzuführen ist. Eine besonders sensitive Methode ist die Färbung mit Fluorochromen. Innerhalb von einigen Minuten liegt das Ergebnis vor, wobei bereits eine erste grobe Zuordnung in Hefen oder Fadenpilze erfolgen kann.2 Auch bei Fadenpilzen kann man bereits orientierende Aussagen treffen. Zygomyzeten wie Rhizopus, Mucor oder Absidia können anhand ihrer Morphologie von anderen Fadenpilzen unterschieden werden. Da Zygomyzeten besonders schnell ins Gewebe vordringen und innerhalb weniger Tage zum Tod führen können, ist ein rascher Nachweis besonders wichtig. Die frühe Kenntnis der Erregergruppe ermöglicht die richtige Therapiewahl und steigert damit die Heilungschance des Patienten.

Kultur
Die Kultur nimmt nach wie vor einen wichtigen Stellenwert ein, obwohl sie vielfach erst nach eini gen Tagen positiv wird, die Sensitivität teilweise unbefriedigend ist und es nicht immer möglich ist, zwischen Kon tamination, Besiedelung und Infektion zu unterscheiden. Allerdings ermöglicht die Kultur, den Erreger bis auf Speziesebene zu identifizieren und eine Resistenzprüfung durchzuführen. Dabei ist jedoch zu beachten, dass es sich bei Nachweis von Hefen auf oberflächlichen Regionen wie Haut oder Schleimhaut sowohl um eine Besiedelung als auch um eine Infektion handeln kann. Bei kulturellem Nachweis von Schimmelpilzen kann auch eine Kontamination aus der Luft vorliegen. Nur in Zusammenschau mit der Klinik und bei Kombination mehrerer diagnostischer Methoden ist es möglich, zwischen Infektion und Nachweis ohne Bedeutung zu unterscheiden. Steriles Material ist besonders gut geeignet, um anhand des Kulturergebnisses eine Diagnose zu stellen und die richtige Therapieentscheidung zu treffen. Blutkulturen, die bei der Diagnose bakterieller Infektionen eine sehr wichtige Rolle spielen, sind zum Nachweis systemischer Infektionen durch Hefen wie z.B. Candida spp. prinzipiell geeignet.

Infektionen durch Fadenpilze sind mittels Blutkultur schwieriger nachzuweisen. So bleibt die Blutkultur bei invasiven Aspergillosen stets negativ. Jedoch ist selbst bei ausgeprägten Candidosen die Sensitivität der Blutkultur nicht immer zufriedenstellend. Hier kann die Harnkultur eine wichtige Zusatzinformation liefern. Diese ist häufig noch vor der Blutkultur positiv, manchmal ist sie sogar der einzige Hinweis auf eine invasive Candidose. Es ist jedoch zu beachten, dass der Nachweis von Candida im Harn auch nur Ausdruck einer Kolonisation sein kann.3
Alle Pilze, die aus sterilen Materialien angezüchtet werden (inklusive Blut, Dialysate, intravenöse Katheterspitzen und bronchoskopisch gewonnene Materialien), müssen unbedingt bis auf Speziesebene identifiziert werden.2 Einerseits gibt die Spezies Auskunft darüber, ob eher eine Kontamination, Besiedelung oder Infektion vorliegt. Auf der anderen Seite kann damit das Resistenzverhalten besser beurteilt und die richtige Therapieentscheidung gefunden werden. So ist C. krusei intrinsisch resistent gegen Fluconazol und in geringerem Ausmaß gegenüber Amphotericin B. C. glabrata ist meist weniger empfindlich gegenüber Fluconazol als andere Candida spp. Zygomyzeten hingegen sprechen auf Azole mit Ausnahme von Posaconazol nicht an. Bei den Aspergillen ist A. terreus als besonders resistenter Vertreter bekannt, sodass hier nur die neueren Antimykotika wie Echinocandine oder die neuen Vertreter der Azole wie z.B. Voriconazol eingesetzt werden sollten.

Antigennachweis
Besonders der Nachweis von Galactomannan (Platelia Aspergillus, Bio-Rad, USA) ist mittlerweile ein gut etablierter Test zum Nachweis von invasiven Aspergillosen in Serum und anderen Körperflüssigkeiten. 1 Bei Nachweis von Galactomannan im Blut müssen mindestens zwei konsekutive Serumproben untersucht werden, um eine fundierte Aussage treffen zu können. Dieser Test kann nicht nur zur frühzeitigen Diagnosestellung einer invasiven Aspergillose beitragen, sondern eignet sich auch zum Monitoring des Therapieerfolgs.

Molekularbiologische Techniken
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von PCR-Assays (Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion) zum Nachweis von Pilzen entwickelt, die in der Erprobung bereits weit fortgeschritten, allerdings noch nicht standardisiert sind. Dabei steht neben der konventionellen PCR mittlerweile auch die Real-Time-PCR zur Verfügung. Die Real- Time-PCR ist eine Weiterentwicklung aus der konventionellen PCR, die den Analysengang verkürzt und eine sehr rasche, nur wenige Stunden dauernde Detektion und Quantifizierung der in der Probe vorhandenen DNA ermöglicht. Da die Kontaminationsgefahr wesentlich geringer als bei der konventionellen PCR ist, sind die mittels Real-Time-PCR erzielten Ergebnisse wesentlich verlässlicher. 4 Bei beiden Formen der PCR werden entweder speziesspezifische Primer verwendet, mit denen der Nachweis nur eines bestimmten Pilzes möglich ist, oder sogenannte panfungale Primer, die eine größere Breite von Pilzen nachweisen. Vergleiche mit dem Galactomannan-Test zeigen, dass beide Techniken ähnlich sensitiv sind und dass sie in Kombination eine höhere Spezifität erreichen. PCR und Galactomannan-Nachweis zur Diagnose von invasiven Aspergillosen sind also nicht austauschbar, sondern ergänzen einander.5, 6

Da neben Aspergillen auch andere Pilzarten immer häufiger als Erreger von invasiven Infektionen bei abwehrgeschwächten Patienten beobachtet werden, gibt es einige wenige Entwicklungen zum Nachweis und zur Differenzierung anderer Pilzarten wie z.B. Zygomyzeten, die derzeit an Häufigkeit zunehmen. Eine breite klinische Evaluierung und Standardisierung der verschiedenen PCR-Protokolle ist jedoch notwendig, bevor der Einsatz dieser neuen Methoden endgültig beurteilt werden kann.

Generell gilt, dass die Interpretation der Ergebnisse zurzeit noch problematisch ist. Vielfach wird eine hohe Sensitivität mit hoher negativer Aussagekraft beschrieben. Das bedeutet, dass negative Ergebnisse in hohem Maße verlässlich sind. Positive Ergebnisse sind hingegen wesentlich schwieriger zu beurteilen. Daher ist es besonders wichtig, alle verfügbaren klinischen Informationen für die endgültige Interpretation des Testergebnisses heranzuziehen. Dabei ist zu beachten, dass die Wahl des Untersuchungsmaterials bereits gravierende Auswirkungen haben kann. Wird das Material vom Infektionsort direkt entnommen, ist mit einer höheren Pilzlast als im Blut zu rechnen, weswegen der Nachweis im Blut wahrscheinlich seltener als im Gewebe gelingt. Eine bereits laufende antimykotische Therapie kann ebenfalls die Pilzlast reduzieren, wodurch bei manchen Assays der DNA-Nachweis erschwert werden kann.

Vollkommen unklar ist die Interpretation von singulären und intermittierend positiven PCR-Ergebnissen bei konsekutiv abgenommenen Proben. Niemand weiß, was es bedeutet, wenn von mehreren Proben einige positive Ergebnisse liefern, die anderen jedoch negativ ausfallen. Möglicherweise sind diese positiven Ergebnisse durch eine Kontamination oder durch eine transiente Besiedelung des Patienten verursacht und klinisch nicht relevant. Es wäre jedoch auch möglich, dass bereits frühe Krankheitsstadien mit unterschiedlich hoher Pilzlast unterschiedlich gut erfasst werden. Auch eine antimykotische Therapie könnte zu intermittierend positiven Ergebnissen führen. Erst nach einer gründlichen Evaluierung wird es möglich sein, diese Assays routinemäßig in jedem diagnostischen Laboratorium einzusetzen.7, 8 Da derzeit kein einziges Testverfahren alleine in der Lage ist, eine invasive Pilzinfektion sicher festzustellen, muss die Diagnose weiterhin durch die gemeinsame Beurteilung von klinischem Bild und den Ergebnissen verschiedener Untersuchungsmethoden im Sinne einer Puzzlediagnostik gestellt werden.

Literatur:
1 Willinger B: Laboratory diagnosis and therapy of invasive infections. Current Drug Targets 2006; 7: 513-522
2 Denning DW, Kibbler CC, Barnes RA: British society for Medical Mycology proposed standards of care for patients with invasive fungal infections. The Lancet Infectious Diseases 2003; 3: 230-240
3 Hennequin C, Ranaivoarimalala C, Chouaki T, Tazerout M, Ancelle T, Cabbaud JJ, Raccurt CP: Comparison of aerobic standard medium with specific fungal medium for detecting Fusarium spp. In blood cultures. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002; 21: 748-750
4 Espy MJ, Uhl, JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, Yao JDC, Wengenack NL, Rosenblatt JE, Cockerill III FR, Smith TF: Real-Time PCR in Clinical Microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Reviews 2006; 19: 165-256
5 Costa C, Costa JM, Desterke C, Botterel F, Cordonnier C, Bretagne S: Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and detection of galactomannan antigen in serum by enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2002; 40: 2224-2227
6 Sanguinetti M, Posteraro B, Pagano L, Pagliari G, Fianchi L, Mele L, La Sorda M, Franco A, Fadda G: Comparison of real-time PCR, conventional PCR, and galactomannan antigen detection by enzymelinked immunosorbent assay using bronchoalveolar lavage fluid samples from hematology patients for diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 2003; 41: 3922-3925
7 White RL, Barnes RA: Aspergillus PCR – platforms, strengths and weaknesses. Med Mycol 2006; 44, S191-S198
8 El-Mahallawy HA, Shaker HH, Ali Helmy H, Mostafa T: Evaluation of pan-fungal PCR assay and Aspergillus antigen detection in the diagnosis of invasive fungal infections in high risk paediatric cancer patients. Med Mycol 2006; 44: 733-739

Autorin: a.o. Univ.-Prof. Dr. Birgit Willinger, Abteilung für Klinische Mikrobiologie Klinisches Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie, Medizinische Universität Wien

Jatros Infektiologie 1/2007