RICHTLINIEN FüR BLUTKULTUR- UND LIQUORDIAGNOSTIK
BLUTKULTURDIAGNOSTIK 1.0 Definition
2.0 Indikationen zur Blutkulturdiagnostik
3.0 Gewinnung und Transport des Untersuchungsmaterials
4.0 Weiterverarbeitung der Blutkulturen im mikrobiologischen Labor
5.0 Antibiotikatestung
6.0 Spezielle Untersuchungsverfahren bei Infektionen mit besonderen Erregern
LIQUOR CEREBROSPINALIS 1.0 Liquordiagnostik
2.0 Indikationen zur Liquordiagnostik
3.0 Gewinnung und Transport des Untersuchungsmaterials
4.0 Weiterverarbeitung von Liquor im mikrobiologischen Labor
5.0 Spezielle Untersuchungsverfahren bei Infektionen mit besonderen Erregern
6.0 Antibiotikatestung
7.0 Befundübermittlung
Literatur
 
BLUTKULTUR- UND LIQUORDIAGNOSTIK

Bundesstaatliche bakteriologisch-serologische Untersuchungsanstalt Klagenfurt
9026 Klagenfurt, Krassnigstraße 5
Direktor: Dr. Evelyn Grund
Tel. 0463/55545-0, Fax 0463/55545-40

Die Richtlinie "Blutkultur- und Liquordiagnostik" wurde am 20.9.2000 unter Leitung von Dr. Ulrich Zerlauth in Klagenfurt (Kärntner Landesarchiv) erarbeitet.



BLUTKULTURDIAGNOSTIK 1.0 Definition
1.1 Bakteriämie, Fungämie

Von einer Bakteriämie oder Fungämie spricht man bei Nachweis von Bakterien bzw. Pilzen im Blut. Es handelt sich um eine mikrobiologische Diagnose und muss nicht immer eine klinische Bedeutung haben oder mit klinischen Symptomen einhergehen und kann transient auftreten.
Sepsis ist eine klinische Diagnose, ein Krankheitsbild, gekennzeichnet durch klinische Hinweise auf eine Infektion.
SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrom) - Antwort auf eine Vielzahl klinischer Ereignisse, deren Ursachen infektiöser, z. B. Sepsis, oder nichtinfektiöser Genese, z. B. Pankreatitis, sein können [1], [2].
Die klinischen Kriterien einer Sepsis werden oft von der subakuten bakteriellen Endokarditis nicht erfüllt. Unterschiedliche klinische Bilder der Sepsis finden sich insbesondere bei Neugeborenen sowie bei geriatrischen und immunsupprimierten Patienten. Eine Blutkultur ist ein bestimmtes Volumen Blut, welches unter aseptischen Kautelen mit Hilfe einer einzigen Venenpunktion für die mikrobiologische Untersuchung gewonnen und in entsprechende Kulturmedien verimpft wird. Dies impliziert, dass auch mehrere mit dem bei einer Venenpunktion gewonnenen Blut beimpfte Blutkulturflaschen als eine Blutkultur zu gelten haben.


2.0 Indikationen zur Blutkulturdiagnostik
Bei Verdacht auf Sepsis, septischen Schock, zyklische Infektionskrankheit, bei Verdacht auf Bakteriämie und Fungämie, bei FUO (fever of unknown origin).
Bei ganz jungen oder alten Patienten, bei Immunsupprimierten, bei Intensivpatienten und bei Patienten mit intravaskulären Implantaten ist die Indikation zur Abnahme von Blutkulturen großzügig zu stellen.
Blutkulturen sind Bestandteil der mikrobiologischen Diagnostik unter anderem bei folgenden Erkrankungen:
Meningitis, Pneumonie, Pyelonephritis, Osteomyelitis, eitrige Arthritis, Epiglottitis bei Kindern, Omphalitis beim Neugeborenen, Abszess, Phlegmone und Endokarditis.


3.0 Gewinnung und Transport des Untersuchungsmaterials
3.1 Entnahmezeitpunkt

Die Wahrscheinlichkeit, einen Erreger in einer Blutkultur nachzuweisen, ist in der Regel unmittelbar vor Auftreten eines Schüttelfrostes am größten. Da jedoch dieses Ereignis nur selten vorauszusehen ist, werden Blutkulturen üblicherweise im Fieberanstieg oder bei Auftreten anderer klinischer Symptome, die auf eine Sepsis hinweisen, entnommen.
Es ist wenig sinnvoll, die Entnahme von Blutkulturen von einer bestimmten Fieberhöhe abhängig zu machen.
Da der Erregernachweis durch eine antibiotische Therapie erschwert wird, sollte die Abnahme der Blutkultur v o r Behandlungsbeginn angestrebt werden.
Bei antibiotisch vorbehandelten Patienten ist die Blutkultur möglichst am Ende eines Antibiotika-Dosierungsintervalls zu entnehmen.
Bei entsprechender klinischer Symptomatik ist auch unter laufender antimikrobieller Behandlung die Anlage weiterer Blutkulturen angezeigt.

3.2 Entnahmeort

In der Regel erfolgt die Blutabnahme durch Punktion einer peripheren Vene. Die Punktion von Venen im Bereich entzündeter Hautareale ist wegen erhöhter Kontaminationsgefahr zu vermeiden.
Bei Neugeborenen kann in den ersten Lebensstunden Blut aus einem Nabelarterienkatheter, später aus Kopfschwartenvenen oder peripheren Venen entnommen werden.
Bei Blutgewinnung über liegende Venenzugänge ist mit einer höheren Kontaminationsrate zu rechnen. Der Abnahmeort ist zu dokumentieren.
Die Verwendung von arteriellem Blut für Blutkulturen bringt keine Vorteile.

3.3 Hautdesinfektion

Die Wahrscheinlichkeit, dass eine positive Blutkultur eine tatsächliche Bakteriämie widerspiegelt, ist abhängig von einer korrekten Entnahmetechnik und der Art des nachgewiesenen Erregers.
Eine sorgfältige Hautdesinfektion ist daher entscheidend, um die Rate kontaminierter Blutkulturen niedrig zu halten.
Die Punktionsstelle wird auf einer ausreichend großen Fläche mit einem Hautdesinfektionsmittel desinfiziert. Dieses wird mit einem Tupfer aufgetragen.
Die erforderliche Einwirkzeit - oder orientierend bis zur Trocknung des Desinfektionsmittels - muss eingehalten werden.
Eine nochmalige Palpation der Punktionsstelle sollte vermieden werden.

3.4 Blutentnahme - Blutvolumen

Zur Blutentnahme werden üblicherweise sterile Spritzen mit großlumigen Kanülen oder spezielle Blutabnahmesysteme verwendet.
Vor der Desinfektion und der Blutabnahme ist eine hygienische Händedesinfektion durchzuführen.
Die meisten Bakteriämien weisen beim Erwachsenen eine Keimzahl von < 1-10 KBE (Kolonie bildende Einheiten)/ml Blut auf.
In der Regel werden für jede Blutkultur, die speziellen Angaben der Hersteller sind zu beachten, 6-20 ml Blut aspiriert und, bei Verwendung von mehr als einer Blutkulturflasche, je die Hälfte in ein aerobes und in ein anaerobes Blutkulturfläschchen überimpft und durch mäßiges Schütteln gut vermischt. Damit wird ein Mischungsverhältnis zwischen Blut und Kulturmedium von 1:5 bis 1:10 erreicht, wodurch die bakterizide Wirkung des Serums neutralisiert wird.
Bei Kindern ist das Ausmaß der Bakteriämie oft erheblich größer (> 100 KBE/ml Blut), sodass ein geringeres Blutvolumen ausreicht - Neugeborene 1-2 ml, Säuglinge 2-3 ml, Kinder 3-5 ml.
Vor Beimpfung der Blutkulturflaschen muss, nach Entfernung der Schutzkappen, der darunter liegende Gummistopfen ebenfalls mit einem Tupfer und Alkohol desinfiziert werden (Einwirkzeit beachten, Alkohol muss vor der Beimpfung vollständig verdunstet sein).
Die Beimpfung der Blutkulturen erfolgt mit der gleichen Kanüle, um Nadelstichverletzungen zu vermeiden. Die Belüftung der aeroben Blutkulturflaschen erfolgt im Labor bzw. nach Herstellerangaben.

3.5 Anzahl der Blutkulturflaschen

Bei vermuteter primärer Bakteriämie oder Fungämie, bei Meningitis, Osteomyelitis, Arthritis oder Pneumonie werden zwei Blutkulturen innerhalb einer Stunde, aber an 2 verschiedenen Punktionsstellen gewonnen. Bei suspekter Bakteriämie oder Fungämie mit wiederholt negativen Blutkulturen oder bei Endokarditis werden drei Blutkulturen während der ersten 1-2 Stunden abgenommen. Wenn diese nach 24 Stunden noch negativ sind, nochmals drei weitere Blutkulturen abnehmen.
Bei FUO werden am Anfang zwei Blutkulturen abgenommen. Dann, nach 24 bis 36 Stunden, werden zwei weitere Blutkulturen abgenommen, womöglich kurz vor dem erwarteten Temperaturanstieg.
Von Patienten, die bis vor 2 Wochen Antibiotika erhalten haben, werden durch 3 Tage hindurch täglich zwei Blutkulturen abgenommen [3].

3.6 Blutkulturmedien

Die Blutkulturflaschen der unterschiedlichen Systeme und Hersteller enthalten nährstoffreiche, flüssige Kulturmedien, erlauben das Wachstum fast aller Mikroorganismen. Kein einzelnes Medium erlaubt jedoch eine optimale Züchtung sämtlicher Mikroorganismen. Antibiotika bindende Medien in Blutkulturen sind nicht verpflichtend.

Folgende Blutkultursysteme stehen zur Verfügung:

Zweiphasige Systeme ("Septi-Check", Becton Dickinson, Sparks, Md.), in derselben Blutkulturflasche befindet sich ein flüssiges Nährmedium und ein integrierter fester Nährboden als Schrägagar, der täglich einmal überflutet wird.

Beim "Signal" Blutkultursystem (Oxoid, Hampshire, England) wird eine positive Kultur dadurch angezeigt, dass durch den beim Bakterienwachstum entstehenden Überdruck die Kulturflüssigkeit in eine aufgesetzte Signalkammer gedrückt wird. Der Überstand bei solcherart positivem Signal wird aerob und anaerob subkultiviert, zusätzlich wird eine Gramfärbung gemacht. Das System ermöglicht den Nachweis von aeroben und anaeroben Bakterien mit nur einer Blutkulturflasche.

Beim Lysis-Zentrifugationsverfahren ("Isolator", Wampole Laboratories, Cranburry, N.J.) wird das Blut vom Einsender in Röhrchen verimpft, die mit Chemikalien versetzt sind. Es kommt zur Lyse der Erythrozyten und Leukozyten, intrazelluläre Erreger werden freigesetzt. Dieses System empfiehlt sich besonders zum Nachweis von Histoplasmose.

Automatische Systeme - durch Verwendung spezieller, für die unterschiedlichen Blutkulturautomaten konzipierte Blutkulturflaschen erfolgt die Detektion des Bakterienwachstums durch photometrische Messung des gebildeten CO2.

3.7 Begleitschein, Beschriftung der Flaschen

Folgende Angaben sind erforderlich:
Persönliche Daten des Patienten (Name, Vorname, Geburtsdatum), Einsender mit Telefonnummer, Aufnahmedatum, Datum und die Uhrzeit der Blutabnahme, Angaben über den Ort der Entnahme (z. B. periphere Vene, zentraler Venenkatheter, Portsystem usw.) sowie klinische Hinweise auf eine möglicherweise prädisponierende Grunderkrankung (z. B. hämatologische Erkrankung mit Neutropenie) und Angaben über eine antibiotische Vorbehandlung.
Um Blutkulturflaschen zuordnen zu können, müssen auch die Flaschen mit Patientennamen, Datum und Uhrzeit der Blutabnahme beschriftet sein.

3.8 Probentransport

Der Transport der beimpften Blutkulturflaschen zum mikrobiologischen Labor sollte unverzüglich erfolgen, eine kurze Lagerung bei Raumtemperatur ist möglich. Auch an Wochenenden ist für einen sofortigen Transport ins Labor zu sorgen, um ein positives Kulturergebnis möglichst frühzeitig zu erhalten.
Bei Überschreiten der maximal empfohlenen Transportzeit des Herstellers wird die Durchführung einer Subkultur und Gramfärbung dringend empfohlen.

3.9 Fehlermöglichkeiten

Unzureichende Hautdesinfektion, Verunreinigung des Gummistopfens der Blutkulturflasche bei der Beimpfung oder Belüftung im Labor, unachtsames Arbeiten bei der Weiterverarbeitung im Labor sind mögliche Ursachen für eine mikrobielle Kontamination der Blutkultur. Durch Minimierung dieser Fehlerquellen lässt sich der Anteil kontaminierter Blutkulturen auf 2 bis 3 % aller Blutkulturen senken.
Ursachen für eine falsche negative Blutkultur können eine vorbestehende antibiotische Therapie, ein zu geringes Beimpfungsvolumen, eine zu lange Transportzeit, gelegentlich auch eine Verwechslung, z. B. durch fehlerhafte Beschriftung von Blutkulturflaschen und Begleitscheinen, sein.

3.10 Leitlinien zu Entnahme und Transport von Blutkulturen

– Blutabnahme möglichst vor Beginn einer antimikrobiellen Therapie, ggf. unmittelbar vor einer Antibiotikagabe.
– Blutabnahme aus zwei verschiedenen Punktionsstellen innerhalb einer Stunde.
– Streng aseptisches Vorgehen bei der Blutabnahme (Händedesinfektion des Arztes, Hautdesinfektion der Punktionsstelle, Desinfektion des Diaphragmas der Blutkulturflasche).
– Blutvolumen nach Herstellerangaben 6-20 ml, bei Kindern 1-5 ml.
– Mitführung eines anaerobiertauglichen Blutkultursystems bei abdominalchirurgischen und bei geburtshilflichen-gynäkologischen Eingriffen.
– Unverzüglicher Transport ins Labor.


4.0 Weiterverarbeitung der Blutkulturen im mikrobiologischen Labor
4.1 Manuelle Bearbeitung von Blutkulturflaschen

4.1.1 Vorbebrütung

Die Mehrzahl der Blutkulturen wird innerhalb der ersten 24 Stunden positiv.
Eine eventuelle Belüftung der aeroben Blutkulturfläschchen erfolgt nach Angaben des Herstellers. Dies erfolgt mittels einer Kanüle über einen bakteriendichten Filter oder in der Sicherheitswerkbank. Vor Durchbrechen des Diaphragmas am Flaschenkopf muss dieses sorgfältig desinfiziert werden. Nach Belüftung ist die Nadel zu entfernen.
Die anaerobe Blutkulturflasche bleibt zur Aufrechterhaltung anaerober Kulturbedingungen unbelüftet. Wegen der unterschiedlichen Ansprüche an die Kulturmedien und den unterschiedlichen Generationszeiten der verschiedenen Bakterienspezies sollte jede Blutkultur zunächst bei 36 +/-1 °C für 6 bis 18 Stunden inkubiert werden, vorher ist mit einem positiven Erregernachweis meist nicht zu rechnen. Durch Schütteln der Blutkulturflaschen während der Bebrütung wird eine erhöhte diagnostische Sensitivität erreicht. Wurde die Flasche bereits vom Einsender im Brutschrank 6 bis 18 Stunden vorbebrütet, kann sofort mit der Weiterverarbeitung begonnen werden.

4.1.2 Mikroskopie

Die Mikroskopie bietet die früheste Möglichkeit, einen Erreger mit konventionellen Methoden nachzuweisen. Für die Mikroskopie geeignet sind nach Gram gefärbte Präparate und Präparate, die mit Acridinorange gefärbt und dann im Fluoreszenzmikroskop beurteilt werden.
Mit der Gramfärbung werden Bakterien erst ab einer Keimzahl von 105/ml nachgewiesen, mit der Acridinorange-Färbung gelingt der Nachweis dagegen bereits bei einer Erregerzahl von 10 4/ml.

4.1.3 Kulturverfahren

Für die aeroben Subkulturen eignet sich Kochblutagar, Columbia-Agar mit 5% defibriniertem Hammelblut (fakultative Bebrütung bei 5-10% CO2) und zusätzlich eventuell ein Differentialmedium wie z. B. MacConkey-Agar. Nach 24 bis eventuell 48 Stunden Bebrütungszeit auf Koloniewachstum prüfen. Dieses Verfahren gewährleistet die Züchtung fast aller medizinisch relevanten aeroben und fakultativanaeroben Erreger.
Für die anaeroben Subkulturen empfiehlt sich die Verwendung von vorreduzierten Nährsubstraten, die Bebrütung erfolgt in sauerstofffreier Atmosphäre in Anwesenheit von 5-10% CO2 (z. B. im Gas-Pak-Topf). Hierzu können Brucellen-Agar oder Schädler-Agar sowie bei entsprechendem klinischen Verdacht eventuell zusätzlich ein Selektivagarmedium verwendet werden.
Nach 24 und eventuell bis 72 Stunden Bebrütungszeit auf Wachstum überprüfen.
Konventionelle Blutkulturflaschen müssen für die Dauer der Bebrütung täglich makroskopisch auf Anzeichen von Bakterienwachstum kontrolliert werden. Bei entsprechendem Verdacht wird ein mikroskopisches Präparat angefertigt und eine Subkultur angelegt.
Für konventionelle Blutkulturen wird eine Bebrütungsdauer von 5 Tagen empfohlen.Eine längere Bebrütungsdauer über 5 Tage hinaus ist für die meisten Erreger normalerweise nicht erforderlich.
Bei Verdacht auf Endokarditis, bei der langsam wachsende Erreger der HACEK-Gruppe (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium, Eikenella und Kingella) vorkommen können, sollte die Bebrütungsdauer länger sein.
Eine vorausgegangene antimikrobielle Therapie führt in der Regel zu einem verzögerten Wachstum der Bakterien.
Am Ende der Bebrütungsdauer kann eine terminale Subkultur unter Verwendung der oben angeführten Medien durchgeführt werden.

4.2 Automatisierte Systeme

Zu den häufigsten eingesetzten Systemen gehören das BacT/Alert-System (Organon Teknika, Turnhout, Belgien), das Bactec-9240-System (Becton Dickinson, Sparks, Md.) und das Vital-System (Bio Merieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich). Die Nachweisverfahren dieser Systeme basieren auf der Messung von Kohlendioxyd, das durch bakterielles Wachstum entsteht. Die Messung erfolgt photometrisch. Die Blutkulturautomaten verfügen über
eine Inkubationseinheit, in die die Flaschen eingebracht und unter Schütteln bebrütet werden, sowie über eine Basiseinheit, in der mittels eines PC die "physikalisch" gemessenen Daten mit verschiedenen Detektionsalgorithmen analysiert werden. Allen modernen Systemen ist gemeinsam, dass ihre Detektionsalgorithmen auch bereits vorbebrütete Flaschen erkennen können. In Abhängigkeit vom verwendeten System besteht die Möglichkeit, dass zu lange vorbebrütete positive Blutkulturflaschen nicht mehr als positiv erkannt werden. In diesem Fall ist bei Einlangen in das Labor unverzüglich eine Subkultur anzulegen und ein Grampräparat anzufertigen.
Empfohlen wird eine Bebrütungsdauer von zumindest 5 Tagen. Indikationen zur Verlängerung der Bebrütungsdauer entsprechen denen konventioneller Bebrütungsverfahren. Eine terminale Subkultur der "Automatenflaschen" kann angefertigt werden. Für die Subkultur von positiv gemeldeten Blutkulturflaschen hat sich die Kombination von Kochblutagar und Columbia-Agar mit 5% defibriniertem Hammelblut bewährt. Meldet der Blutkulturautomat eine positive Flasche, wird umgehend ein mikroskopisches Präparat angefertigt und eine Subkultur angelegt. Das weitere Vorgehen
(Resistenztestung und Erregeridentifizierung) entspricht dem Vorgehen bei herkömmlichen Systemen.
Die durchschnittlichen Detektionszeiten liegen bei etwa 24 Stunden. Fällt bei vom Blutkultursystem als "positiv" gemeldeten Kulturen das Ergebnis der mikroskopischen Untersuchung negativ aus, wird die Blutkulturflasche nach Anlegen einer entsprechenden Subkultur wieder in das Gerät eingebracht.
Nach einer Musterung des mikroskopischen Präparates und unter Berücksichtigung der klinischen Diagnose muss über eine Modifikation der Standardbebrütung (z. B. Bebrütungszeit, Umgebungstemperatur) und eine Modifikation der Subkultur (z. B. Einsatz von Spezialnährböden, Bebrütungszeit) nachgedacht werden. Dies führt dann gelegentlich zur Züchtung seltener Erreger.
Auf jeden Fall sollte eine solche Blutkulturflasche am Ende der Gesamtbebrütungszeit (mind. 14 Tage) subkultiviert werden. Dies gilt generell auch für alle Blutkulturen bei Endokarditis-Verdacht, die bis zu 28 Tage bebrütet werden.

Die eindeutigen Vorteile der automatisierten Blutkulturdiagnostik sind:

die Vermeidung routinemäßiger Subkulturen und mikroskopischer Präparate (primär und terminal).
eine kontinuierliche Beobachtung und Messung der Blutkulturflaschen, d. h. auch über Nacht und an den Wochenenden,
eine kürzere Nachweiszeit aufgrund kontinuierlicher Bebrütung, Schütteln der Flaschen und durch eine zügigere Bearbeitung und Befunderhebung mittels Datenverarbeitung.


5.0 Antibiotikatestung
Bei mikroskopischem Erregernachweis ist entsprechend dem Grampräparat zusätzlich zu den Kulturen eine Empfindlichkeitsprüfung gegenüber geeigneten Antibiotika (nach NCCLS) und eine Erregeridentifizierung direkt aus der Blutkulturflasche durchzuführen. Bei Verdacht auf Endokarditis wird eine MHKBestimmung für Penicillin G und eine Bestimmung der High Level Aminoglycosid Resistance für vergrünende Streptokokken, Streptococcus bovis und Enterococcus sp. empfohlen. Eine E-Test-Nachtestung kann erfolgen [4].


6.0 Spezielle Untersuchungsverfahren bei Infektionen mit besonderen Erregern
6.1 Brucellose

Generell sind bei Verdacht auf Brucellose mehrere Blutkulturen an aufeinanderfolgenden Tagen abzunehmen. Die Dauer der Bebrütung beträgt 4 bis 6 Wochen, einmal pro Woche wird auf Brucella-Agar subkultiviert und bei 5-10% CO2-Spannung über 14 Tage bebrütet.
In der Brucellose-Diagnostik haben sich zweiphasige Systeme als geeignet erwiesen. Bei diesen Systemen wird in einwöchigem Abstand durch Kippen der Blutkulturflasche die Agarfläche überflutet und so beimpft. Auch in Blutkulturautomaten werden Brucellen mit ausreichender Zuverlässigkeit angezeigt.
Auf die Notwendigkeit zusätzlicher serologischer Untersuchungen sei an dieser Stelle hingewiesen.

Die hohe Infektiosität von Brucellosekulturen rechtfertigt die Antibiotikaprophylaxe beim Laborpersonal.

6.2 Leptospirose

Leptospiren sind nur in der akuten septischen Krankheitsphase der Leptospirose innerhalb der ersten Krankheitswoche im Blut nachzuweisen. Röhrchen, die 5 ml kaninchenserumhaltige Fletcher-Bouillon enthalten, werden mit einigen Tropfen Frischblut beimpft, bebrütet, sowie wöchentlich im Dunkelfeld eines unter der Oberfläche des Mediums gewonnenen Tropfen mikroskopiert.
Bebrütung im Dunkeln bei 28-29 ac über 6 Wochen.
Wöchentliche mikroskopische Untersuchung im Dunkelfeld eines unter der Oberfläche des Mediums gewonnen Tropfens.
Bei Leptospiroseverdacht sind zusätzliche serologische Untersuchungen dringend erforderlich.

6.3 Bartonellose

Bartonella (Rochalimaea) henselae, der Erreger der Katzenkratzkrankheit, lässt sich gelegentlich auch aus Blutkulturen isolieren. Zur primären Züchtung eignen sich sowohl konventionelle als auch automatisierte Blutkultursysteme. Von besonderer Bedeutung ist hier die ausreichend lange Inkubation auch der Subkulturmedien - mindestens 14 Tage in 5% CO2-angereicherter Atmosphäre mit ausreichender Luftfeuchtigkeit und die Verwendung nährstoffreicher Medien wie beispielsweise Kochblutagar.

6.4 Sprosspilze

Sprosspilze können mit üblichen Blutkultursystemen gezüchtet werden. Besteht der Verdacht auf eine Fungämie, so sollten die Medien (aerobe Blutkulturflasche) und auch die Subkultur bei 22-30 °C bebrütet werden. Da bei Sprosspilznachweis in Blutkulturflaschen die üblichen makroskopischen Zeichen von mikrobiellem Wachstum (Trübung, Gasbildung) fehlen können, können mehrfache Subkulturen auch makroskopisch unverdächtiger Flaschen nötig sein, um Sprosspilze frühzeitig nachzuweisen. Die Subkultur wird zusätzlich auf Selektivmedien (z. B. Kimmig-Agar
oder Sabouraud-Glucose-Agar) angelegt, bei Wachstum weitere Differenzierung.

Bei Verdacht auf Krytokokkose werden terminale Subkulturen empfohlen.
Der Nachweis von Histoplasma capsulatum erfordert das Lysis-Zentrifugationsverfahren [5].

6.5. Mykobakterien

Der Nachweis von Mykobacterium tuberculosis und atypischen Mycobakterien gelingt mittels spezieller Blutkulturmedien z. B. mit dem BacT/Alert-System (Organon Teknika, Turnhout, Belgien) oder dem Bactec-System (Becton Dickinson, Sparks, Md.) Bei Wachstum weitere Differenzierung und Resistenztestung nach Standardmethoden.


LIQUOR CEREBROSPINALIS 1.0 Liquordiagnostik
1.1 Definition

Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus Großhirn, Kleinhirn, Brücke, Hirnstamm, Rückenmark und den Hirnhäuten (Dura mater, Arachnoidea, Pia mater).
Im Raum dazwischen findet sich der Liquor cerebrospinalis, im englischen Schrifttum cerebrospinal fluid (CSF).
Liquor wird in den Plexus chorioidei im Gehirn gebildet, umspült das ZNS mit Nährstoffen und dient als hydraulischer Polster.
Die Blut-Liquorschranke erschwert die Passage von Mikroorganismen und toxischen Stoffwechselprodukten in den Liquor.
Resorbiert wird der Liquor von den großen Venen der Meningen.
Das Aussehen des Liquors ist wasserklar, enthält weniger als 12/3 Zellen/ml, das sind weniger als 5 Zellen/ml.
Die Zellen sind lymphozyten und vereinzelt Monozyten.
Der Eiweißgehalt beträgt unter 50 mg/dl, der Glukosegehalt 50-75 mg/dl, das entspricht 60-70% des Blutglukosegehaltes.
Infektionen können direkt in das ZNS einwandern (z. B. Otitis media), über die Schädel- und RÜckenmarknerven aufsteigen (z. B. Herpes-Varizellen-Zoster-Virus) oder über den Blut- oder Lymphweg das ZNS erreichen.
Anatomische Defekte begünstigen das Entstehen von ZNS-Entzündungen. Solche Defekte können, traumatisch bedingt, chirurgisch hervorgerufen oder angeboren sein.

Man unterscheidet die

– eitrige Meningitis: durch Bakterien, Pilze, und gelegentlich Protozooen
– aseptische Meningitis: Fehlen der oben genannten Mikroorganismen. Meist sind Viren die Ursache, aber auch Tumoren oder Blutungen.
– Enzephalitis: meist virale Ätiologie, aber auch Erkrankungen, die mit einer Demyelinisierung einhergehen.
– Poliomyelitis: ist die selektive Zerstörung der motorischen Vorderhornzellen, begleitet von einer aseptischen Meningitis.
– ZNS-Abzesse: sind seltener als eitrige Meningitiden. Sie können sich entweder im ZNS-Gewebe oder zwischen den Hirnhäuten entwickeln. Ursachen für ihr Auftreten ist ein mit Bakterien oder Pilzen infizierter Embolus, ein Durchwandern einer benachbarten Infektion oder nach neurochirurgischen Interventionen.


2.0 Indikationen zur Liquordiagnostik
Bei jeglichem Verdacht auf eine zerebrale Mitbeteiligung bei Infektionskrankheiten, bei Meningismus, bei unklarer Bewusstseinsstörung und bei unklaren Krampfanfällen (auch bei Erwachsenen).
Wenn eine Liquorpunktion nicht möglich ist, ist eine Blutkultur erforderlich.


3.0 Gewinnung und Transport des Untersuchungsmaterials
3.1 Entnahmezeitpunkt

Da der Erregernachweis durch eine antibiotische Therapie erschwert wird, empfiehlt es sich, die Abnahme der Liquorkultur v o r Behandlungsbeginn durchzuführen.
Es wird empfohlen, gleichzeitig Blutkulturen abzunehmen, Rachenabstriche und Hautbiopsien von Petechien können angezeigt sein.

3.2 Entnahmeort

Lumbalpunktion: Punktion des Duralsackes zwischen dem 3. und 4. oder 4. und 5. Lendenwirbeldornfortsatz mit langer Hohlnadel.

Ventrikelpunktion: in Narkose nach CT-Aufnahmen, Aufbohren des Schädels, Punktion des Ventrikels und Einführen eines Silikonröhrchens.

Liquorableitungssystem

3.3 Hautdesinfektion

Gewinnung von Liquor unter streng aseptischen Kautelen.
Zumindest eine zweimalige Hautdesinfektion der Punktionsstelle mit einem 70%igen alkoholischen oder einem jodhältigen Präparat, das für die präoperative Hautantiseptik geeignet ist. Dies wird mit sterilen Tupfern aufgetragen.
Bei der Punktion trägt der Arzt sterile Einmalhandschuhe.

3.4 Liquorvolumen und Anzahl der Liquorröhrchen

Liquor soll nach erfolgreicher Lumbalpunktion in sterile, dicht verschließbare Röhrchen abtropfen.
Es ist üblich, 3 oder mehrere Röhrchen Liquor für mikrobiologische, hämatologische, immunologische und chemische Analysen zu gewinnen. Optimal ist das 2. Röhrchen für die Bakterienkultur. Die Menge für das 1. Röhrchen beträgt weniger als 1 ml, es ist am ehesten kontaminiert. Die Mindestmenge für die Kultur sollte nicht weniger als 1 ml betragen. Die Röhrchen sind nach der Gewinnung fest zu verschließen.
Material von Biopsien und Abzessen muss in anaerobiertauglichen Transportmedien dem Labor überbracht werden oder unmittelbar nach der Gewinnung verarbeitet werden.

3.5 Begleitschein, Beschriftung

Folgende Angaben sind erforderlich:
Persönliche Daten des Patienten (Name, Vorname, Geburtsdatum), Einsender bzw. Station mit Telefonnummer, Datum und Uhrzeit der Liquorabnahme, klinische Diagnose, Symptome, anamnestische Daten (Reise?), antibiotische Vorbehandlung.

Um Liquorröhrchen zuordnen zu können, müssen auch die Röhrchen mit Patientennamen, Datum und Uhrzeit der Abnahme beschriftet sein.

3.6 Probentransport

So schnell als möglich ins mikrobiologische Labor überbringen.
Neben dem Versand von Nativliquor ist auch der Ver sand von mit Liquor beimpften Nährmedien möglich. Der Posttransport für die Virologie erfolgt in sterilen Röhrchen und gekühlt.


4.0 Weiterverarbeitung von Liquor im mikrobiologischen Labor
4.1 Mikroskopie

Die Sensitivität der Labormethoden zum Nachweis von Mikroorganismen im Liquor hängt von der gewonnenen Menge ab. Liquor für die Bakterienkultur sollte zentrifugiert werden. Diese Prozedur verbessert die Ausbeute der Mikroskopie und Kultur. Der Überstand kann für chemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden. Der Bodensatz wird für das mikroskopische Präparat und die Kultur verwendet.
Eine bessere Möglichkeit, Liquor zu mikroskopieren, ist nach Anreicherung mit der die Zyto-Zentrifuge. 1/2 ml Liquor reicht für einen Objektträger. Die Morphologie von Bakterien und Entzündungszellen bleibt gut erhalten.
Die mikroskopische Untersuchung des Liquorsediments ist eine bewährte und genaue Methode für die Diagnose Meningitis. Bakterielle Meningitis kann mittels Gramfärbung diagnostiziert werden. Aufgrund der möglicherweise geringen Keimmenge im Liquor müssen die Präparate sorgfältig durchmustert werden.
Akridin-Orange kann die Empfindlichkeit erhöhen, positive Präparate müssen aber noch Gram-gefärbt werden, um Bakterien zu verifizieren, dies geht ohne vorherige Entfärbung.
Für besondere Fragestellungen stehen Spezialfärbungen (z. B. Calcofluor-White-Färbung zum Nachweis von Cryptococcus neoformans) zur Verfügung.

4.2 Nährmedien und Kultur

Viren, Bakterien, Mykobakterien, Pilze und Parasiten sind imstande, ZNS-Infektionen zu verursachen. Die Krankheitserreger können beim Patienten nach Immunstatus, Alter, Grundkrankheit, aber auch nach Tierkontakt und Auslandsaufenthalt (z. B. Brucella sp.) variieren.
Neugeborene: Keime, die im mütterlichen Genitaltrakt zum Zeitpunkt der Geburt vorhanden sind, wie z. B. E.coli, Streptococcus agaläctiae und Listeria monozytogenes.
Kleinkinder können an Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae erkranken.
Immunsupprimierte erkranken an Listeria, Nocardia, Pseudomonas, Cryptococcus, Aspergillus, Toxoplasma.
Die Ursachen für Hirnabzesse sind meist endogenen Ursprungs. Anaerobier, meist Peptostreptococcus sp., Fusobakterium sp., Prevotella sp., Erreger der HACEK-Gruppe, aber auch Staphylokokken und Streptokokken können mitbeteiligt sein.
Nach neurochirurgischen Eingriffen und nach Traumen finden sich auch gramnegative Keime.
Im Liquor von Patienten mit einem ZNS-Shunt finden sich meist Staphylococcus sp., coryneforme Bakterien und Propionibacterium sp.
Als Kulturmedien werden Brain-Heart-Infusion oder Thioglycolatbouillon verwendet, an festen Nährböden Columbia-Agar mit5 % defibriniertem Hammelblut und Kochblutagar. Die Platten werden zumindest für 48 Stunden bei 36 +/-1 ac, eventuell bei 5-10% CO2 inkubiert, täglich auf Wachstum kontrolliert und bei Nichtwachstum nach 48 Stunden können die Platten verworfen werden.
Für die Anaerobierdiagnostik Thioglycolatbouillon für 5 Tage bei 36 +/-1 aC bebrüten (vorreduziert). Bei Trübung auf geeignete Festnährböden ausimpfen, aerob und anaerob bebrüten, zusätzlich ein Grampräparat anfertigen. An festen Nährböden können Columbia-Agar mit 5 % defibriniertem Hammelblut, Kochblutagar und Schädler-Agar verwendet werden und in sauerstofffreier Atmosphäre in Anwesenheit von 5-10% CO2 bebrütet werden.

Die Bebrütungsdauer beträgt 72 Stunden bei 36 +/-1 °C. Nach 48 Stunden kann eine Zwischenbefundung erfolgen. Konnten im Präparat Keime nachgewiesen werden, die Platten aber nach 72-stündiger Bebrütung steril sein, erfolgt eine weitere Bebrütung für 3 bis 5 Tage.
Aus der Bouillon mit Abszess- oder Biopsiematerial empfiehlt es sich, vor dem Verwerfen ein Präparat anzufertigen. Eine Subkultur wird bei jedem Verdacht auf Wachstum angelegt. Für langsam wachsende Organismen wird eine Bebrütungsdauer von 7 Tagen empfohlen.


Latex-Agglutination
Für Haemophilus influenzae Typ b, Streptococcus pneumonie, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae und E.coli gibt es kommerzielle Latex-
Agglutinations-Kits. Der Wert dieser Kits liegt vor allem in der Bestätigung von mikroskopischen Ergebnissen, nur eingeschränkt eignen sie sich für ein generelles Screening.
Für Cryptococcus neoformans bieten sich Antigen-Nachweisverfahren (z. B. Elisa) als Screening an.


5.0 Spezielle Untersuchungsverfahren bei Infektionen mit besonderen Erregern
5.1 Mykobakterien

Für die Diagnose säurefester Stäbchen stehen die Auramin- und die Ziehl-Neelsen-Färbung zur Verfügung. Da die Anzahl säurefester Stäbchen im Liquor sehr gering ist, müssen die Präparate sorgfältig durchmustert werden.
FÜr die Kultur so viel Liquor wie möglich (nach Mögllichkeit nicht weniger als 2 ml).
Eine Materialdekontaminienation ist nicht erforderlich, eine direkte Verarbeitung ist möglich.
Für die Tuberkulosediagnostik stehen auch automatisierte Systeme zur Verfügung, wie z. B. Bactec MGIT (Becton Dickinson, Sparks, Md.) oder BacT/Alert-System (Organon Teknika, Turnhout, Belgien).
Nährmedien entsprechend der Richtlinie "Diagnostik von Mykobakterien", bei Wachstum erfolgt eine weitere Differenzierung und Resistenztestung mit Standardmethoden.

5.2 Pilze

8eimpfen eines Selektivmediums, wie z. 8. Sabouraud-Dextrose-8ouillon und bei 22-30 °C zumindest 1 Woche inkubieren, öfters auf Wachstum kontrollieren.
Proben von immunsupprimierten Patienten werden auch auf Cryptococcus untersucht, für den Nachweis ist die maximal erhältliche Liquormenge erforderlich. Die Calcoflour-White-Färbung verbessert die Pilzdiagnostik.
8ei Wachstum weitere Differenzierung.

5.3 Viren

Erreger von ZNS-Infektionen viraler Genese sind das Mumpsvirus, Enteroviren, HSV (Herpes-simplex-Virus), HIV (Human-Immundeficiency-Virus), EBV (Ebstein-Barr-Virus), VZV (Varicellen-Zoster-Virus), Arboviren, Masernvirus und Tollwutvirus.
Die Diagnose erfolgt über einen direkten Erregernachweis (PCR) und/oder spezifische intrathekal im Serum gebildete Antikörper.

5.4 Protozooen

In Österreich finden sich am häufigsten ZNS-Infektionen mit Toxoplasma gondii. Die Zysten bleiben beim Immunkompetenten reaktionslos im Gehirn, bei Immunsupprimierten kann es zu einer Enzephalitis kommen.
Entamoeba histolytica kann Hirnabszess verursachen, Naegleria sp. und Acanthamoeba sp. können über die Nase (Fila olfactoria) in das ZNS gelangen und sich im Gehirn massiv vermehren.
Die Diagnose erfolgt radiologisch und serologisch bei Toxoplasmose, durch direkten Erregernachweis aus dem Liquor bei einer Amöbenmeningoenzephalitis. Bei Echinokokkose und Zystizerkose erfolgt der Nachweis serologisch.


6.0 Antibiotikatestung
Bei mikroskopischem Erregernachweis ist zusätzlich zu den Kulturen eine Direkttestung gegenüber geeigneten (liquorgängigen) Antibiotika anzusetzen und eine Erregeridentifizierung durchzuführen.
Eventuell Bestätigung des Antibiogramms nach Erregerwachstum (nach NCCLS).


7.0 Befundübermittlung
Positive Ergebnisse müssen telefonisch mitgeteilt werden, Uhrzeit und Name der Empfängerperson werden dokumentiert. Ein gedruckter Zwischenbefund sollte übermittelt werden. Ein Endbefund wird nach abgeschlossener Identifikation und AB-Testung übermittelt.




Literatur
1. Bone R. C., Balk R. A., Cerra F. B., et al. Definitions for Sepsis and organ Failure and Guidelines for the use of innovative Therapies in Sepsis. Chest. 1992; 101 : 1644-1655.

2. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference Committee. Definition for Sepsis and organ Failure and Guidlines for the Use of innovative Therapies in Sepsis. Crit. Care Med. 1992; 20: 864-874.

3. Cumitech 1 B Blood Cultures III 1997, America Society for Microbiology.

4. Wilson Walter R. and the Endocarditis Working Group of the International Society for Chemotherapy; Antibiotic treatment of infective endocarditis due to viridans streptococci and other streptococci. Clinical Microbiology and Infection 1998; 4: 3S17-3S27.

5. Merz William G., Roberts Glenn D.: Detection and Recovery of Fungi from Clinical Specimens. Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Chapter 94: S1167-1183.
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