RICHTLINIEN FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK VON INFEKTIONEN DER TIEFEN ATEMWEGE
| Die Richtlinien für die "Mikrobiologische Diagnostik von Infektionen der tiefen Atemwege" wurden im Rahmen eines Workshops in Anlehnung an die Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) und der American Society for Microbiology (ASM) erarbeitet. Der Workshop fand am 28. März 2000 an der Bundesstaatlichen bakteriologisch-serologischen Untersuchungsanstalt Salzburg unter der Koordination von Dr. Dagmar Achleitner statt. |
Infektionen der tiefen Atemwege gehören zu den Infektionen mit besonders breitem Erregerspektrum. In Abhängigkeit von Grundkrankheiten und Ort des Infektionserwerbes reicht das Erregerspektrum von klassischen bakteriellen Erregern über "atypische" Organismen, Viren, Mykobakterien und Pilzen bis zu Protozoen.
Klinisch und pathologisch-anatomisch äußern sich Atemwegsinfektionen in oberflächlichen oder bis ins Interstitium reichenden Entzündungsreaktionen in Abhängigkeit vom ursächlichen Erreger und von der Reaktionslage des betroffenen Organismus.
Während in früheren Zeiten die Lobärpneumonie durch Streptococcus pneumoniae mit >90% aller Erkrankungsfälle im Vordergrund stand ist in den letzten Jahren vielfach eine Verschiebung des Erregerspektrums aufgetreten (neue Erreger, Änderung des Spektrums der Grundkrankheiten v. a. Krankheiten mit Abwehrschwäche, Selektion und Resistenzentwicklung). Grundsätzlich unterscheidet man zwischen ambulant erworbenen (community aquired) Pneumonien und nosokomialen Pneumonien (Auftreten >48 Stunden nach Krankenhauseintritt).
A) Ambulant erworbene Pneumonien:
Erregerhäufigkeit:
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Chlamydien
Mycoplasmen
Legionellen
Viren
B) Nosokomiale Pneumonien:
• nosokomiale Pneumonien bei spontan atmenden Patienten
• nosokomiale Beatmungspneumonien
Erregerhäufigkeit:
Enterobacteriacae
Pseudomonas spp v.a. Pseudomonas aeruginosa)
Staphylococcus aureus
C) Pneumonien bei Immunsupprimierten Patienten
D) Aspirationspneumonien
E) Pneumonien bei Patienten mit Grundkrankheiten der Lunge
Indikationen zur mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik:
1) Ambulant erworbene Pneumonien mit schwerem Verlauf
2) Pneumonien im Anfangsstadium mit eitrigem Auswurf sowie zusätzlichen Risikofaktoren (>65 a, Diabetes mellitus, andere schwere Grundkrankheiten)
3) Nosokomiale Pneumonien
4) Persistierende Infiltrate
5) Pneumonien bei immunsupprimierten Patienten
6) Therapieversagen
7) Häufige Schübe von akuten Bronchitiden mit eitrigem Auswurf
8) Erfassung resistenter Erreger bzw. Resistenzentwicklung
Keine Indikation: banale Infektionen - empirische Therapie
Wichtig für die mikrobiologische Pneumoniediagnostik ist die Kenntnis
1) der typischen oropharyngealen Flora,
2) der potentiell pathogenen Keime und
3) der obligat pathogenen Keime.
Die mikrobiologische Diagnostik sollte gezielt und in Stufen erfolgen.
Stufe 1:
Primärdiagnostik aerob schnell wachsender Mikroorganismen sollte in jedem Routinelabor möglich sein
Stufe 2:
erweiterte Primärdiagnostik (Legionellen, Mycoplasmen, Chlamydien, Nocardien ...)
Voraussetzung: gezielte Fragestellung durch Kliniker
Stufe 3:
spezialisierte Diagnostik (seltene und schwierig zu diagnostizierende Erreger) z.B. außereurop. Mykosen, Protozoen, Aktinomyceten, Viren, sehr seltene Infektionen durch z. B. Anaerobier.
Klinisch und pathologisch-anatomisch äußern sich Atemwegsinfektionen in oberflächlichen oder bis ins Interstitium reichenden Entzündungsreaktionen in Abhängigkeit vom ursächlichen Erreger und von der Reaktionslage des betroffenen Organismus.
Während in früheren Zeiten die Lobärpneumonie durch Streptococcus pneumoniae mit >90% aller Erkrankungsfälle im Vordergrund stand ist in den letzten Jahren vielfach eine Verschiebung des Erregerspektrums aufgetreten (neue Erreger, Änderung des Spektrums der Grundkrankheiten v. a. Krankheiten mit Abwehrschwäche, Selektion und Resistenzentwicklung). Grundsätzlich unterscheidet man zwischen ambulant erworbenen (community aquired) Pneumonien und nosokomialen Pneumonien (Auftreten >48 Stunden nach Krankenhauseintritt).
A) Ambulant erworbene Pneumonien:
Erregerhäufigkeit:
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Chlamydien
Mycoplasmen
Legionellen
Viren
B) Nosokomiale Pneumonien:
• nosokomiale Pneumonien bei spontan atmenden Patienten
• nosokomiale Beatmungspneumonien
Erregerhäufigkeit:
Enterobacteriacae
Pseudomonas spp v.a. Pseudomonas aeruginosa)
Staphylococcus aureus
C) Pneumonien bei Immunsupprimierten Patienten
D) Aspirationspneumonien
E) Pneumonien bei Patienten mit Grundkrankheiten der Lunge
Indikationen zur mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik:
1) Ambulant erworbene Pneumonien mit schwerem Verlauf
2) Pneumonien im Anfangsstadium mit eitrigem Auswurf sowie zusätzlichen Risikofaktoren (>65 a, Diabetes mellitus, andere schwere Grundkrankheiten)
3) Nosokomiale Pneumonien
4) Persistierende Infiltrate
5) Pneumonien bei immunsupprimierten Patienten
6) Therapieversagen
7) Häufige Schübe von akuten Bronchitiden mit eitrigem Auswurf
8) Erfassung resistenter Erreger bzw. Resistenzentwicklung
Keine Indikation: banale Infektionen - empirische Therapie
Wichtig für die mikrobiologische Pneumoniediagnostik ist die Kenntnis
1) der typischen oropharyngealen Flora,
2) der potentiell pathogenen Keime und
3) der obligat pathogenen Keime.
Die mikrobiologische Diagnostik sollte gezielt und in Stufen erfolgen.
Stufe 1:
Primärdiagnostik aerob schnell wachsender Mikroorganismen sollte in jedem Routinelabor möglich sein
Stufe 2:
erweiterte Primärdiagnostik (Legionellen, Mycoplasmen, Chlamydien, Nocardien ...)
Voraussetzung: gezielte Fragestellung durch Kliniker
Stufe 3:
spezialisierte Diagnostik (seltene und schwierig zu diagnostizierende Erreger) z.B. außereurop. Mykosen, Protozoen, Aktinomyceten, Viren, sehr seltene Infektionen durch z. B. Anaerobier.
Die Wahrscheinlichkeit einen klinisch relevanten Infektionserreger zu isolieren ist umso größer, je näher am Infektionsherd die Probenentnahme erfolgt.
Die Probengewinnung sollte möglichst vor der antimikrobiellen Therapie erfolgen.
Der Zeitraum zwischen Probengewinnung und Verarbeitung sollte möglichst kurz sein (idealerweise ~1 - 2 Stunden), um einerseits das Absterben von empfindlichen Erregern zu vermeiden und andererseits das überwuchern durch Kontaminationskeime zu verhindern.
Vorgangsweise bei längerer Transportdauer: Ein nach der Probenentnahme angefertigtes Ausstrichpräparat kann Aufschluss über die quantitative und qualitative Erregerzusammensetzung der Probe geben.
Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards (MIQ)
Sekrete aus dem Respirationstrakt können in der Regel nicht durch Transportsysteme geschützt werden.
Die Verwendung von Transportmedien und Kühlung der Proben wird nicht generell angeraten.
Die Probengewinnung sollte möglichst vor der antimikrobiellen Therapie erfolgen.
Der Zeitraum zwischen Probengewinnung und Verarbeitung sollte möglichst kurz sein (idealerweise ~1 - 2 Stunden), um einerseits das Absterben von empfindlichen Erregern zu vermeiden und andererseits das überwuchern durch Kontaminationskeime zu verhindern.
Vorgangsweise bei längerer Transportdauer: Ein nach der Probenentnahme angefertigtes Ausstrichpräparat kann Aufschluss über die quantitative und qualitative Erregerzusammensetzung der Probe geben.
Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards (MIQ)
Sekrete aus dem Respirationstrakt können in der Regel nicht durch Transportsysteme geschützt werden.
Die Verwendung von Transportmedien und Kühlung der Proben wird nicht generell angeraten.
Die mikrobiologische Diagnostik stützt sich auf die Untersuchung von in verschiedenen Abschnitten des Respirationstraktes abgesonderten Sekreten. Diese können entweder spontan durch Expektoration oder instrumentell/operativ gewonnen werden. Bei der Materialgewinnung ist zu beachten, dass der Erreger dem Nachweis entgehen kann:
– Durch zu geringes Vorkommen des Erregers in Sekreten
– Bestehende Bronchialobstruktion/stenosen
III.1. Sputum
Ist das am häufigsten eingesandte Material zur Diagnostik von Pneumonien.
Vorteile:
– reproduzierbar, nicht invasiv und für den Patienten wenig belastend.
Nachteile:
– Kontamination durch oropharyngeale Flora/Speichelbeimengung
– Sensitivität und Spezifität der Sputumkultur für Pneumoniediagnostik < 50%
III.1.1. Gewinnung und Transport
Richtige Gewinnung des Sputums aus der Tiefe ist die Voraussetzung für eine gute Sputumqualität. Dazu ist sowohl die Unterweisung durch geschultes Personal als auch die Kooperationsbereitschaft des Patienten notwendig.
Vorgehen:
Mundspülung mit Leitungswasser (evtl. Entfernung von Zahnersatz), mehrmals tief Ein- und Ausatmen, nach dem Einatmen Atem ca. 4 sec. anhalten
Probenanzahl:
eine einzige Sputumprobe von guter Qualität kann bei bakteriellen Pneumonien ausreichend sein, mehrere zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Sputen wären jedoch anzuraten.
24 Std. Sammelsputum ist obsolet
Transport:
der Zeitraum zwischen Gewinnung und Verarbeitung sollte idealerweise nicht mehr als 2 Std. betragen (das Mengenverhältnis der enthaltenen Keime kann sich quantitativ verschieben: Überwucherung durch oropharyngeale Flora, Autolyse
und Lyse durch Leukozytenenzyme).
Induziertes Sputum:
wenn spontan kein Sputum produziert werden kann, oder wenn eine invasive Diagnostik nicht möglich ist.
Inhalation von ca. 25 ml steriler hyperosmolarer (3%iger) Kochsalzlösung mittels Ultraschallvernebler.
Nachteil: benötigt Physiotherapeuten.
III.1.2. Makroskopische Untersuchung
Ausbreitung des Sputums in einer sterilen Petrischale und Prüfung gegen einen dunklen Hintergrund (schleimig, eitrig, blutig). Mit Nadel und Öse wird anschließend versucht Bronchialsekret und Eiterbestandteile von der Speichelflüssigkeit zu trennen. Purulente Anteile sollten für die mikroskopische Untersuchung und Kultur verwendet werden.
Auswaschmethode nach Mulder:
Eiterpartikel oder zähschleimige Partikel mit Ringerlösung übergießen, gut mischen (Öse oder steriles Holzstäbchen), Flüssigkeit absaugen und zu Boden gesunkenes Material weiterverarbeiten.
Diese Methode wird von den meisten Autoren als zu umständlich und zeitaufwendig bezeichnet und bringt kaum Vorteile hinsichtlich der Qualität der Ergebnisse. Mikroskopisches Screening ist eher anzuraten als spezielle "Prozeduren" durchzuführen, und dann ein eher grenzwertiges Sputum zu kultivieren.
III.1.3. Mikroskopische Untersuchung
Patientenproben des Respirationstraktes müssen routinemäßig mikroskopisch untersucht werden.
1.3.1. mikroskopisch-zytologische Untersuchung
– Bei Sputen ermöglicht ein sogenanntes zytologisches Screening einen Rückschluss auf die Qualität der Probe. Nur durch mikroskopisch-zytologisches Screening als geeignet befundene Proben sollten kultiviert werden.
– Die mikroskopische Untersuchung ist an Hand eines gefärbten Präparates möglich.
Mindestanforderung: Gram-Färbung
(MIQ) Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards
Es wird zusätzlich eine Methylenblaufärbung oder Giemsa-Färbung empfohlen (bessere Zelldifferenzierung).
Als Beurteilungskriterien zur Bewertung von Sputumproben werden die Anzahl an Plattenepithelien und (segmentkernigen neutrophilen) Granulozyten herangezogen.
Kriterien:
1 ) Kriterien nach Bartlett:
Untersuchung von mindestens 5 Gesichtsfeldern (GF) bei 80-100facher Vergrößerung
– Gruppe 1: <10 Granulozyten/GF, > 25 Plattenepithelien/GF: nicht geeignetes Material
– Gruppe 2: 10-25 Granulozyten, > 25 Plattenepithelien: nicht geeignetes Material
– Gruppe 3: > 25 Granulozyten, > 25 plattenepithelien: bedingt geeignetes Material
– Gruppe 4: > 25 Granulozyten, 10-25 Plattenepithelien: geeignetes Material
– Gruppe 5: > 25 Granulozyten, < 10 Plattenepithelien: sehr gut geeignetes Material
– Gruppe 6: < 25 Granulozyten, < 25 Plattenepithelien: bedingt geeignetes Material, z.B. neutropenischer Patient
Diese Kriterien gelten nicht:
– für Patienten mit Immunsuppression (entzündliche Reaktion fehlt, Granulozyten vermindert ...)
– für Patienten mit zystischer Fibrose
Gruppe 1-2: sind medizinisch nicht relevant und sollten eigentlich nicht kultiviert werden.
Gruppe 3: es besteht eine relativ starke Kontamination mit oropharyngealer Flora. Weitere mikrobiologische Untersuchungen sollten nur nach Rücksprache mit dem behandelnden Arzt (bei besonders wichtigen Proben) durchgeführt werden.
Gruppe 1-3:
bei Kultivierung sollte die Kontamination auf dem Befund festgehalten werden.
Gruppe 4-6:
weitere mikrobiologische Untersuchungen.
2) Kriterien nach EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
– Untersuchung von mindestens 10 repräsentativen Gesichtsfeldern: vorzugsweise sollten Areale mit Leukozyten untersucht werden. Areale mit oropharyngealer Kontamination sollten vermieden werden.
cPlattenepithelien (PE) und polymorphkernige Leukozyten (PMN) sollten im Verhältnis 1 : 2 vorhanden sein.
3) Kriterien: College of American Pathologists
(Q-Probes-Quality-Assurances Services)
– < 10 PE > 25 PMN's
– Proben sollten verworfen werden, wenn: > 10 PE und < 25 PMN's oder > 25 PE (ungeachtet der PMN's) vorhanden sind.
4) Kriterien nach Burkhardt:
– Es dürfen höchstens 25 PE/GF vorhanden sein, um ein Sputum als verwertbar einzustufen. Zugleich sollte mindestens die gleiche Anzahl an Leukozyten vorhanden sein.
– > 25 PE/GF: die Proben haben nur bei gleichzeitig höherem Leukozytengehalt eine potentiell diagnostische Bedeutung. Die Interpretation sollte mit Zurückhaltung durchgeführt werden.
– < oder = 25 PE/GF: es besteht in der Regel eine gute Übereinstimmung zwischen den Kulturergebnissen von Sputum und Transtrachealem Aspirat (TTA)
1.3.2. mikroskopisch-bakteriologische Untersuchung:
1. Kriterien MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards:
+: bis 10 Organismen (Keime)/GF wenige
++: 10 bis 100 -"- mäßig
+++ : > oder = 100 -"- reichlich
Bei typischer Morphologie (z. B. Strept. pneumoniae, Haem. influenzae) und größerer Anzahl (>10 Org./GF) sollte eine Verdachtsdiagnose über den Erreger geäußert werden.
2. Kriterien EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
Eine semiquanitative Bestimmung der Zellen (Plattenepithelien und Granulozyten) und eine semiquantitative Bestimmung der Mikroorganismen sollte durchgeführt werden.
Semiquantitave Bestimmung der Mikroorganismen:
a) Vorherrschen eines Mikroorganismus in einem entzündlichen Areal: Semiquantitative Angabe
b) zusätzliches Vorhandensein anderer Bakterien: Semiquantitative Angabe als gemischte "Morphotypen"
c) kein Vorherrschen eines Mikroorganismus: Semiquantitative Angabe als gemischte bakterielle "Morphotypen"
d) Pilzstrukturen und Hefezellen: Hyphenstrukturen sollten semiquantifiziert werden und als "Hyphen vorhanden" angegeben werden.
III.1.4. Kultur
1.4.1. Kulturmedien zur Anzüchtung der häufigsten aeroben, schnell wachsenden Mikroorganismen
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards:
Mindestanforderung:
3 feste Kulturmedien als Basiskulturansatz.
a) Bluthaltiges Agarmedium (z.B. Columbia-Agar oder Hirn-Herz-Dextrose-Agar mit Zusatz von 5% Schafblut)
+ "Amme" Staph. aureus-Impfstrich über 2. und 3. fraktioniertem Ausstrich (X und V-Faktor abhängige Haemophilus spp.)
+ Nalidixinsäure-Plättchen (30µg)
(gramnegative Erreger können im Wachstum gehemmt werden)
b) Kochbluthaltiges Agarmedium (z.B. Columbia-Agar oder Hirn-Herz-Dextrose-Agar)
+ Plättchen: z.B. Oleandomycin (15µg), Bacitracin (10 IE)
(Hemmung grampositiver Bakterien der oropharyngealen Flora - bessere Erkennung von Haemophilus)
c) Laktose-lndikator-Agar (z.B. MacConkey- oder Endo- Agar) als Selektivmedium für Enterobacteriaceae, Pseud. spp. und andere Nonfermenter
Bestimmte potentiell pathogene Keime können durch zerfallende Leukozyten und Leukozytenenzyme und hohe Konzentrationen von Keimen der Oropharyngealflora (vergrünende Streptokokken) im Wachstum gehemmt werden (Pneumokokken, Moraxella, Staph. au-
reus, ß-hämolysierende Streptokokken ...).
Daher sollten bei eitrigem Probenmaterial, bei schweren chronischen Krankheitsprozessen und bei CF die Proben nach Homogenisierung verdünnt werden (z.B. 1 : 100) und weitere Medien routinemäßig verwendet werden.
d) erweiterter Basisansatz:
– Mannit-Kochsalzplatte: Staph. aureus, MRSA
– Ticarcillinplatte: Burkholderia cepacia
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology:
a) Blut-Agar (mit 5% Schafblut)
b) Kochblut-Agar
c) MacConkey- oder Eosinmethylenblau-Agar
d) Bouillonen sind bei Sputum n i c h t indiziert.
CUMITECH (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology)
a) Blut-Agar
b) Kochblut-Agar: nur wenn die Gramfärbung ein dominantes Vorkommen (> oder = 10 Organismen/GF bei 1000-facher Vergrößerung Ölimmersion) von Haemophilus spp. oder Neisseria spp. zeigt.
c) MacConkey-Agar oder Eosinmethylenblau-Agar
d) Bouillonen und Anaerobierkulturen sowie stark selektive Medien sind abzulehnen, da sie zu Fehlinterpretationen führen können (Besiedlung, unterschiedliche Wachstumsrate verschiedener Bakterien in Flüssigmedien Verzerrung der Erregerverteilung...)
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
a) Blut-Agar
b) Kochblut-Agar
c) MacConkey-Agar
d) evtl. Columbia-Agar mit Colistin und Nalidixinsäure
BURKHARDT:
a) Blut-Agar
+ Staph. aureus Impfstrich
+ Optochinplättchen
b) Kochblut-Agar
+ Plättchen mit Oleandomycin (15µg) oder Bacitracin (10 IE) im Grenzbereich Primär- und Sekundärausstrich
c) Lactose-Indikator-Nährböden (MacConkey, Drigalski, Endo ...)
d) evtl. Ansatz eines Hemmstofftestes zum Nachweis einer antibakteriellen Aktivität. Dieser gibt jedoch nur in Einzelfällen einen Hinweis für die Bewertung und hat nicht dieselbe Bedeutung wie bei Harnwegsinfekten.
e) Pilznährböden: (Sabouraud-Glukose-Agar, Kimming-Agar, Giozotia-Kreatinin-Nährboden....)
-bei vorausgehender längerer Antibiotikatherapie
-bei konkretem Mykoseverdacht
1.4.2. Verarbeitung
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Fraktionierter 3-Ösenausstrich:
Mit abgeflammter Öse wird eine punktförmige Beimpfung der ausgewählten Platte durchgeführt und im ersten Sektor der erste Ösenausstrich gemacht.
Nach Abflammen der Öse wird der 2. Ösenausstrich im 2. Sektor und nach neuerlichem Abflammen der 3. Ausstrich im 3. Sektor gemacht.
Inkubation:
Bei 36 ± 1°C:
a) Blut-Agar und Kochblut-Agar müssen in 5 -10 %iger CO2-Atmosphäre bebrütet werden.
b) andere Agarplatten können in 5 -10 %iger CO2 -Atmosphäre oder normaler Atmosphäre bebrütet werden.
c) Anaerobe Kultur bei Sputum ist nicht zielführend.
1.4.3. Bewertung und Interpretation:
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Die Kultur sollte nach dem 1. Tag (12- 18 Stunden) und am 2. Tag (48 Stunden) nach Anlegen der Probe abgelesen werden.
Eine semiquantitative Beurteilung ist ausreichend.
Ausnahme: bei eitrigen Patientenproben und Patienten mit zystischer Fibrose sollte nach entsprechender Homogenisierung eine quantitative Kultur durchgeführt werden.
Semiquantitative Bewertung des 3. Ösenausstriches
CUMITECH (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology):
Die Kultur sollte nach dem ersten Tag (12-18) Stunden abgelesen werden. Eine neuerliche Ablesung nach 48 Stunden ist nur dann notwendig, wenn der Patient unter Antibiotikatherapie steht oder Organismen, die als Infektionserreger in Betracht kommen, noch nicht isoliert wurden, aber in der Gramfärbung ersichtlich waren.
Semiquantitative Bewertung
Identifizierung, Protokollierung und Anlegen eines Antibiogramms nur bei vorherrschenden Organismen (= +++, ++++).
Die meisten Pathogene sind in Mengen von +++ bis ++++ vorhanden.
Ausnahme: Obligat pathogene Erreger oder spezielle Angaben des Klinikers.
Ob die Anwesenheit von vergrünenden Streptokokken, koagulasenegativen Staphylokokken erwähnt werden soll, wenn sie dominant erscheinen oder ob sie unter die normale Rachenflora subsummiert werden sollen, ist fraglich und stellt noch ein Problem dar.
Corynebakterien sind äußerst selten Erreger von Infektionen der tiefen Atemwege und müssen nicht identifiziert werden.
Ausnahme: wenn sie in der Gramfärbung dominant sind.
Enterobacteriaceae sind häufig Erreger bei hospitalisierten und abwehrgeschwächten Patienten, kaum jedoch Erreger bei ambulant erworbenen Pneumonien. Sie sind häufig als Kolonisationskeime des oberen Respirationstraktes bei Alkoholabusus, älteren Patienten und bei bestehender Antibiotikatherapie anzutreffen (cave: zu häufiges Isolieren und Protokollieren).
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
1) Kein möglicher pathogener Keim (Keime die mit Infektionen des unteren Respirationstraktes assoziiert sein können) vorhanden:
Bewertung als normale Flora des oberen Respirationstraktes.
2) Vorhandensein von einem oder zwei möglichen Pathogenen:
Semiquantifizierung, Identifizierung und Anlegen eines Antibiogramms; zusätzliche Semiquantifizierung der normalen Flora des oberen Respirationstraktes.
3) Vorhandensein von >2 möglichen Pathogenen:
Semiquantifizierung, Identifizierung und Antibiogramm von bis zu 2 dominanten möglichen pathogenen. Wenn keines der möglichen Pathogene vorherrschend ist, sollten sie semiquantifiziert und identifiziert werden. Zusätzlich Semiquantifizierung der normalen
Flora des Oropharyngealraumes.
4) Die Menge an möglichen Pathogenen ist > als die Menge der normalen Flora des oberen Respirationstraktes:
Ouantifizierung, Identifizierung und Antibiogramm von Organismen deren Menge mäßig bis reichlich ist, zusätzlich Angabe der Menge der normalen Oropharyngealflora.
5) Reinkultur eines Organismus, der Bestandteil der normalen Oropharyngealflora ist: Semiquantifizierung und Identifizierung.
DGHM (Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie):
Eine semiquantitative Beurteilung ist ausreichend.
Unterscheidung in:
– normale Standardflora: Semiquantifizierung
– obligat pathogene Erreger: Semiquantifizierung, Identifizierung und Anlegen eines Antibiogramms (unabhängig von der Menge).
– fakultativ pathogene Arten:
1) Je stärker ein Keim, der als Entzündungserreger in Betracht kommen kann, gegenüber der Oropharyngealflora in den Vordergrund tritt, desto wahrscheinlicher ist seine ätiologische Bedeutung.
2) Erreger die wiederholt nachgewiesen werden, auch wenn sie in geringe Mengen vorhanden sind, können Entzündungsursache sein.
3) Ätiologisch relevante Arten können hinter der Oropharyngealflora zurücktreten z.B. Nocardien.
III. 2. Trachealsekret, Tubussekret
III.2.1. Gewinnung
Sekrete sollten unter Zuhilfenahme eines sterilen Katheters aus den tiefen Abschnitten des Bronchialbaumes aspiriert werden.
III.2.2. Makroskopische Untersuchung
Siehe Sputumuntersuchung
III.2.3. Mikroskopie
Siehe Sputumuntersuchung
III.2.4. Kultur
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Vorbereitung: Vermischung mittels Vortex für 1 Minute, evtl. Verflüssigung bei sehr zähen Sekreten (z. B. 1%-ige N-Acetyl-L-Cystein-Lösung oder Sputasol® zu gleichen Anteilen hinzufügen und 1 Minute gut mischen).
2.4.1. Kulturmedien
Basiskulturansatz und erweiterter Kulturansatz entspricht dem des Sputums.
2.4.2. Verarbeitung
Quantitative Kulturansätze werden bevorzugt
• Herstellen von Serienverdünnungen mit isotoner Kochsalzlösung (z. B. 1:100, 1: 10.000).
• Von der Originalsuspension werden 10µl auf die Agarplatten (Basisansatz) und von jeder Verdünnung ebenfalls jeweils 1µl ausgespatelt.
2.4.3. Bewertung und Interpretation
Die Ablesung der Kulturen erfolgt am 1. Tag (nach 12-18 Stunden) und am 2. Tag (ca. 48 Std.). Spezialkulturen werden je nach Selektivplatten bis zu 4 Wochen bebrütet.
Ermittlung der KBE /ml:
KBE/ml = die Zahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor x Inokulationsfaktor
Diagnositische Schwellwertkonzentrationen:
Schwierigkeiten bei der Interpretation:
Die Besiedlung der Trachea mit oropharyngealer Flora oder Umgebungskeimen tritt nach Anlegen eines Trachealtubus / Tracheostomas relativ rasch ein (innerhalb 24 Std.). Zusätzlich kann auch durch die zelluläre Zusammensetzung des Materials kein eindeutiger zuverlässiger Rückschluss auf eine Infektion gezogen werden, da auch relativ rasch eine Entzündungsreaktion des Trachealepithels eintritt.
Tracheostoma:
Aspirate und Absaugungen sollten wie Sputum behandelt werden.
III.3. Bronchialsekret
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
III.3.1. Gewinnung
Die Aspiration des Bronchialsekrets erfolgt über den Arbeitskanal des Bronchoskops; evtl. vor der Aspiration instillieren einer geringen Menge einer isotonen Lösung, die keine antibakteriellen Zusätze enthält (Ringerlaktat ...)
Indikationen zur Bronchoskopie:
chronische Infekte, therapieresistente, hartnäckige Infekte
Immunkompromittierte Patienten
DD: Neoplasie oder Infektion?
V.a. Infektion mit Pneumocystis carinii
III.3.2. Makroskopische Untersuchung
Wie bei Sputum und Trachealsekret
III.3.3. Mikroskopische Untersuchung
Wie bei Sputum und Trachealsekret
III.3.4. Kultur
3.4.1. Kulturmedien
wie bei Sputum und Trachealsekret
3.4.2. Verarbeitung
quantitative Kulturansätze werden bevorzugt.
• Homogenisieren der Probe
• Herstellung von Serienverdünnungen
• Ausspateln von 100 µl der Originalsuspension und 100 µl der Verdünnungen auf Agarplatten (Basisansatz).
III.4. BAL(bronchoalvoläre Lavage)
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
III.4.1. Gewinnung
Absaugen der Sekrete des Naso-Oropharyngealraumes. Lokalanästhetikum sollte mittels Vernebler appliziert werden (anästhesierende Gele können antimikrobiell wirken!).
Einführen des Bronchoskops und instillieren von bis zu 160 ml isotoner Kochsalzlösung (mini BAL bis 30 ml). Mindestens 50 ml der instillierten Flüssigkeit sollten wiedergewonnen werden. Das erste Aspirat wird verworfen (Ausnahme: Suche nach obligat-pathogenen Erregern bei abwehrgeschwächten Patienten).
III.4.2. Mikroskopisch-zytologische Untersuchung
Bei BAL-Flüssigkeit sollte eine differentialzytologische Untersuchung durchgeführt werden.
Sie kann sowohl eine wertvolle Hilfe bei der Diagnostik von bakteriellen, viralen Infektionen, Pilzinfektionen und Infektionen mit Pneumocystis carinii sein, als auch differentialdiagnostische Hinweise auf nichtinfektiöse Lungenerkrankungen geben.
Zur Herstellung von zytologischen Präparaten sollte eine Zytozentrifuge verwendet werden.
Färbungen:
Gramfärbung
Methylenblaufärbung
Zusatzfärbungen: Färbung nach Giemsa bzw. nach Pappenheim (differentialzytologische Untersuchungen)
Interpretation der Färbungen:
• Plattenepithelien: > 1 % (bei 1000-facher Vergrößerung) an der Gesamtheit der nachweisbaren Zellen spricht für eine Kontamination mit oropharyngealer Flora
• Granulozyten: > 20% sind ein Hinweis auf eine Entzündung bzw. Infektion
• Lymphozyten: >10% kann auf eine Infektion durch Viren, Pilze oder Protozoen hinweisen
Zellverteilung in der BAL-Flüssigkeit ohne Infektion :
Alveolarmakrophagen: 96 ± 3 %
Lymphozyten: 3 ± 2%
Neutroph.Granulozyten: 1 ± 1 %
Eosinoph. Granulozyten: <1%
III.4.3. Kultur
4.3.1. Kulturmedien
a) Basiskulturansatz
b) Flüssiges. nicht selektives Nährmedium
(z. B.Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon) zur Anreicherung von wenigen oder geschädigten Bakterien.
c) Anaerobe Kulturverfahren
nur bei Verdacht auf Aspirationspneumonie und nur mit quantitativer Kultur.
Laut amerikanischen Richtlinien ist BAL nicht geeignet für die Anaerobierkultur.
d) Spezialkulturen mit Selektivnährböden (für Candida, Schimmelpilze, Legionellen, Nocardien)
4.3.2. Verarbeitung
Ein quantitatives Kulturverfahren ist einzusetzen (Spezifität wird dadurch erhöht).
• Homogenisieren der Probe
• Serienverdünnung mit isotoner Kochsalzlösung
• 100 µl der Originalsuspension und 100 µl von jeder Verdünnung werden auf Agarplatten gleichmäßig ausgespatelt.
4.3.3. Beurteilung
Ablesung nach 12-18 stündiger und 48 stündiger Bebrütung. Spezialkulturen werden je nach Selektivplatten bis zu 4 Wochen bebrütet.
Ermittlung der KBE/ml.
• >10 4 KBE gelten als diagnostisch aussagekräftig für eine Pneumonie.
• nach antibiotischer Therapie kann auch ein potentiell pathogener Erreger in niedriger Konzentration von Bedeutung sein.
III.5. Geschützte Bürste (protected specimen brush = PSB)
MIQ (Mikroskopisch-Infektiologische Qualitätsstandards):
III.5.1. Gewinnung
Eine von zwei Teleskopkathetern umhüllte Bronchialbürste wird durch den Arbeitskanal des Bronchoskops eingeführt. Der innere Katheter wird vorgeschoben und anschließend die Bürste mittels Führungsdraht aus dem inneren Katheter an die geeignete Stelle herausgeschoben. Nach "Bürsten" der besagten Stelle wird die Bürste in den inneren Katheter zurückgezogen, der innere Katheter in den äußeren.
Vorteil: Kontaminationsarme Probengewinnung
Häufig eindeutig diagnostische Aussage möglich
Gelegentlich das beste, verfügbare Untersuchungsmaterial (v.a. bei Beatmungspneumonien).
Nachteil: Geringe Probenmenge (0,001 -0,01 ml)
III.5.2. Mikroskopische Untersuchung
5.2.1. mikroskopisch zytologische Untersuchung:
wie bei BAL
III.5.3. Kultur
5.3.1. Kulturmedien
MIQ (Mikroskopisch-Infektiologische Qualitätsstandards):
wie bei BAL
EPCM (Essential Procedures für Clinical Microbiology):
anaerobe Kultur nur nach Anfrage
CUMITECH (Cumulative Techniaues and Procedures in Clinical Microbiology):
aerobe und anaerobe Kultur
5.3.2. Verarbeitung
MIQ (Mikrobiologisch-Infektiologische Oualitätsstandards):
Die Bürste wird in 1 ml Bouillon (Ringerlaktatlösung) 1 min. lang gut gemischt. Die Verdünnung der Probe beträgt ca 10-³ bei einer Probenmenge von 0,001 ml. Herstellen von Serienverdünnungen und Ausspateln von 100 µl Originalsuspension und 100 µl jeder Verdünnung.
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
Die Bürste wird in 1ml steriler Kochsalzlösung oder BHI-Bouillon gemischt und anschließend 10 µl auf Platten ausgespatelt.
KBE/ml: Anzahl der Kolonien / Platte x Verdünnungsfaktor
5.3.3. Beurteilung
Grenzwerte von >= 10³ KBE/ml gelten als diagnostisch aussagekräftig für das Vorliegen einer Pneumonie.
III.6. Transtracheales Aspirat (TTA)
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Oualitätsstandards):
Vorteil:
Kontaminationsfreie Probengewinnung,
alle Mikroorganismen sind als Entzündungserreger zu werten
Gutes Material für Anaerobierkultivierung
Nachteil:
Belastung des Patienten
Komplikationen und Nebenwirkungen
Ausreichende Übung und Erfahrung des durchführenden Arztes ist notwendig
Dieses Verfahren wird heute kaum mehr durchgeführt.
III.7. Lungenbiopsie
Vorteil:
Bestes Untersuchungsmaterial,
keine Kontamination mit oropharyngealer Flora
Nachteil:
Narkose und Operationsrisiko
Indikation:
Wenn alle anderen diagnostischen Verfahren ausgeschöpft sind.
III.7.1. Transport
Biopsate sollten nativ (evtl. in physiologischer Kochsalzlösung) unverzüglich ins Labor transportiert werden.
III.8. Transthorakale Feinnadelpunktion
Vorteil:
Keine Kontamination mit oropharyngealer Flora
Geeignetes Material für Anaerobierkultivierung
Nachteil:
Komplikationen: Pneumothorax, Blutungen,
Indikation, Mikroskopie, Transport, Kultur und Beurteilung wie bei offener Lungenbiopsie.
III.9. Pleuraflüssigkeit
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Oualitätsstandards):
Bei bestehendem Pleuraerguss oder -empyem ist der Nachweis von Erregern von großer diagnostischer Bedeutung.
III.9.1. Mikroskopie
Mindestanforderung: Gramfärbung
III.9.2. Transport
Pleuraflüssigkeit kann in der zur Punktion verwendeten Spritze versandt werden. Bei Verdacht auf Anaerobier kann alternativ ein Anaerobiertransportmedium verwendet werden. Zusätzlich kann ein Flüssigmedium (Blutkulturmedium) beimpft werden.
III.9.3. Kultur
9.3.1. Kulturmedien
a) Basiskulturansatz
b) Flüssiges nichtselektives Anreicherungsmedium
c) Anaerobes Kultivierungsverfahren
d) Spezialkultur mit Selektivmedien bei gezielter Fragestellung
e) Kultur auf Mykobakterien
III.10. Blutkultur
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Blutkulturen sind obligat bei allen schwerverlaufenden Pneumonien
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
Blutkulturen sollten immer bei Patienten mit Pneumonien angelegt werden.
– Durch zu geringes Vorkommen des Erregers in Sekreten
– Bestehende Bronchialobstruktion/stenosen
III.1. Sputum
Ist das am häufigsten eingesandte Material zur Diagnostik von Pneumonien.
Vorteile:
– reproduzierbar, nicht invasiv und für den Patienten wenig belastend.
Nachteile:
– Kontamination durch oropharyngeale Flora/Speichelbeimengung
– Sensitivität und Spezifität der Sputumkultur für Pneumoniediagnostik < 50%
III.1.1. Gewinnung und Transport
Richtige Gewinnung des Sputums aus der Tiefe ist die Voraussetzung für eine gute Sputumqualität. Dazu ist sowohl die Unterweisung durch geschultes Personal als auch die Kooperationsbereitschaft des Patienten notwendig.
Vorgehen:
Mundspülung mit Leitungswasser (evtl. Entfernung von Zahnersatz), mehrmals tief Ein- und Ausatmen, nach dem Einatmen Atem ca. 4 sec. anhalten
Probenanzahl:
eine einzige Sputumprobe von guter Qualität kann bei bakteriellen Pneumonien ausreichend sein, mehrere zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Sputen wären jedoch anzuraten.
24 Std. Sammelsputum ist obsolet
Transport:
der Zeitraum zwischen Gewinnung und Verarbeitung sollte idealerweise nicht mehr als 2 Std. betragen (das Mengenverhältnis der enthaltenen Keime kann sich quantitativ verschieben: Überwucherung durch oropharyngeale Flora, Autolyse
und Lyse durch Leukozytenenzyme).
Induziertes Sputum:
wenn spontan kein Sputum produziert werden kann, oder wenn eine invasive Diagnostik nicht möglich ist.
Inhalation von ca. 25 ml steriler hyperosmolarer (3%iger) Kochsalzlösung mittels Ultraschallvernebler.
Nachteil: benötigt Physiotherapeuten.
III.1.2. Makroskopische Untersuchung
Ausbreitung des Sputums in einer sterilen Petrischale und Prüfung gegen einen dunklen Hintergrund (schleimig, eitrig, blutig). Mit Nadel und Öse wird anschließend versucht Bronchialsekret und Eiterbestandteile von der Speichelflüssigkeit zu trennen. Purulente Anteile sollten für die mikroskopische Untersuchung und Kultur verwendet werden.
Auswaschmethode nach Mulder:
Eiterpartikel oder zähschleimige Partikel mit Ringerlösung übergießen, gut mischen (Öse oder steriles Holzstäbchen), Flüssigkeit absaugen und zu Boden gesunkenes Material weiterverarbeiten.
Diese Methode wird von den meisten Autoren als zu umständlich und zeitaufwendig bezeichnet und bringt kaum Vorteile hinsichtlich der Qualität der Ergebnisse. Mikroskopisches Screening ist eher anzuraten als spezielle "Prozeduren" durchzuführen, und dann ein eher grenzwertiges Sputum zu kultivieren.
III.1.3. Mikroskopische Untersuchung
Patientenproben des Respirationstraktes müssen routinemäßig mikroskopisch untersucht werden.
1.3.1. mikroskopisch-zytologische Untersuchung
– Bei Sputen ermöglicht ein sogenanntes zytologisches Screening einen Rückschluss auf die Qualität der Probe. Nur durch mikroskopisch-zytologisches Screening als geeignet befundene Proben sollten kultiviert werden.
– Die mikroskopische Untersuchung ist an Hand eines gefärbten Präparates möglich.
Mindestanforderung: Gram-Färbung
(MIQ) Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards
Es wird zusätzlich eine Methylenblaufärbung oder Giemsa-Färbung empfohlen (bessere Zelldifferenzierung).
Als Beurteilungskriterien zur Bewertung von Sputumproben werden die Anzahl an Plattenepithelien und (segmentkernigen neutrophilen) Granulozyten herangezogen.
Kriterien:
1 ) Kriterien nach Bartlett:
Untersuchung von mindestens 5 Gesichtsfeldern (GF) bei 80-100facher Vergrößerung
– Gruppe 1: <10 Granulozyten/GF, > 25 Plattenepithelien/GF: nicht geeignetes Material
– Gruppe 2: 10-25 Granulozyten, > 25 Plattenepithelien: nicht geeignetes Material
– Gruppe 3: > 25 Granulozyten, > 25 plattenepithelien: bedingt geeignetes Material
– Gruppe 4: > 25 Granulozyten, 10-25 Plattenepithelien: geeignetes Material
– Gruppe 5: > 25 Granulozyten, < 10 Plattenepithelien: sehr gut geeignetes Material
– Gruppe 6: < 25 Granulozyten, < 25 Plattenepithelien: bedingt geeignetes Material, z.B. neutropenischer Patient
Diese Kriterien gelten nicht:
– für Patienten mit Immunsuppression (entzündliche Reaktion fehlt, Granulozyten vermindert ...)
– für Patienten mit zystischer Fibrose
Gruppe 1-2: sind medizinisch nicht relevant und sollten eigentlich nicht kultiviert werden.
Gruppe 3: es besteht eine relativ starke Kontamination mit oropharyngealer Flora. Weitere mikrobiologische Untersuchungen sollten nur nach Rücksprache mit dem behandelnden Arzt (bei besonders wichtigen Proben) durchgeführt werden.
Gruppe 1-3:
bei Kultivierung sollte die Kontamination auf dem Befund festgehalten werden.
Gruppe 4-6:
weitere mikrobiologische Untersuchungen.
2) Kriterien nach EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
– Untersuchung von mindestens 10 repräsentativen Gesichtsfeldern: vorzugsweise sollten Areale mit Leukozyten untersucht werden. Areale mit oropharyngealer Kontamination sollten vermieden werden.
cPlattenepithelien (PE) und polymorphkernige Leukozyten (PMN) sollten im Verhältnis 1 : 2 vorhanden sein.
3) Kriterien: College of American Pathologists
(Q-Probes-Quality-Assurances Services)
– < 10 PE > 25 PMN's
– Proben sollten verworfen werden, wenn: > 10 PE und < 25 PMN's oder > 25 PE (ungeachtet der PMN's) vorhanden sind.
4) Kriterien nach Burkhardt:
– Es dürfen höchstens 25 PE/GF vorhanden sein, um ein Sputum als verwertbar einzustufen. Zugleich sollte mindestens die gleiche Anzahl an Leukozyten vorhanden sein.
– > 25 PE/GF: die Proben haben nur bei gleichzeitig höherem Leukozytengehalt eine potentiell diagnostische Bedeutung. Die Interpretation sollte mit Zurückhaltung durchgeführt werden.
– < oder = 25 PE/GF: es besteht in der Regel eine gute Übereinstimmung zwischen den Kulturergebnissen von Sputum und Transtrachealem Aspirat (TTA)
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Mikroskopie: – Gramfärbung – Semiquantitative Beurteilung von Granulozyten und Plattenepithelien |
1.3.2. mikroskopisch-bakteriologische Untersuchung:
1. Kriterien MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards:
+: bis 10 Organismen (Keime)/GF wenige
++: 10 bis 100 -"- mäßig
+++ : > oder = 100 -"- reichlich
Bei typischer Morphologie (z. B. Strept. pneumoniae, Haem. influenzae) und größerer Anzahl (>10 Org./GF) sollte eine Verdachtsdiagnose über den Erreger geäußert werden.
2. Kriterien EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
Eine semiquanitative Bestimmung der Zellen (Plattenepithelien und Granulozyten) und eine semiquantitative Bestimmung der Mikroorganismen sollte durchgeführt werden.
Semiquantitave Bestimmung der Mikroorganismen:
a) Vorherrschen eines Mikroorganismus in einem entzündlichen Areal: Semiquantitative Angabe
b) zusätzliches Vorhandensein anderer Bakterien: Semiquantitative Angabe als gemischte "Morphotypen"
c) kein Vorherrschen eines Mikroorganismus: Semiquantitative Angabe als gemischte bakterielle "Morphotypen"
d) Pilzstrukturen und Hefezellen: Hyphenstrukturen sollten semiquantifiziert werden und als "Hyphen vorhanden" angegeben werden.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Mindestanforderung: – Gramfärbung – Die Untersuchung erfolgt bei 800 bis 1000-facher Vergrößerung (Ölimmersion). Es sollten mindestens 5 GF ausgezählt werden, bevorzugt Areale mit hohem Leukozytengehalt. Jede Bakteriengruppe (z.B. gram-positive Diplokokken, monomorphe gram-negative Stäbchen ...) wird semiquantitativ angegeben. |
III.1.4. Kultur
1.4.1. Kulturmedien zur Anzüchtung der häufigsten aeroben, schnell wachsenden Mikroorganismen
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards:
Mindestanforderung:
3 feste Kulturmedien als Basiskulturansatz.
a) Bluthaltiges Agarmedium (z.B. Columbia-Agar oder Hirn-Herz-Dextrose-Agar mit Zusatz von 5% Schafblut)
+ "Amme" Staph. aureus-Impfstrich über 2. und 3. fraktioniertem Ausstrich (X und V-Faktor abhängige Haemophilus spp.)
+ Nalidixinsäure-Plättchen (30µg)
(gramnegative Erreger können im Wachstum gehemmt werden)
b) Kochbluthaltiges Agarmedium (z.B. Columbia-Agar oder Hirn-Herz-Dextrose-Agar)
+ Plättchen: z.B. Oleandomycin (15µg), Bacitracin (10 IE)
(Hemmung grampositiver Bakterien der oropharyngealen Flora - bessere Erkennung von Haemophilus)
c) Laktose-lndikator-Agar (z.B. MacConkey- oder Endo- Agar) als Selektivmedium für Enterobacteriaceae, Pseud. spp. und andere Nonfermenter
Bestimmte potentiell pathogene Keime können durch zerfallende Leukozyten und Leukozytenenzyme und hohe Konzentrationen von Keimen der Oropharyngealflora (vergrünende Streptokokken) im Wachstum gehemmt werden (Pneumokokken, Moraxella, Staph. au-
reus, ß-hämolysierende Streptokokken ...).
Daher sollten bei eitrigem Probenmaterial, bei schweren chronischen Krankheitsprozessen und bei CF die Proben nach Homogenisierung verdünnt werden (z.B. 1 : 100) und weitere Medien routinemäßig verwendet werden.
d) erweiterter Basisansatz:
– Mannit-Kochsalzplatte: Staph. aureus, MRSA
– Ticarcillinplatte: Burkholderia cepacia
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology:
a) Blut-Agar (mit 5% Schafblut)
b) Kochblut-Agar
c) MacConkey- oder Eosinmethylenblau-Agar
d) Bouillonen sind bei Sputum n i c h t indiziert.
CUMITECH (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology)
a) Blut-Agar
b) Kochblut-Agar: nur wenn die Gramfärbung ein dominantes Vorkommen (> oder = 10 Organismen/GF bei 1000-facher Vergrößerung Ölimmersion) von Haemophilus spp. oder Neisseria spp. zeigt.
c) MacConkey-Agar oder Eosinmethylenblau-Agar
d) Bouillonen und Anaerobierkulturen sowie stark selektive Medien sind abzulehnen, da sie zu Fehlinterpretationen führen können (Besiedlung, unterschiedliche Wachstumsrate verschiedener Bakterien in Flüssigmedien Verzerrung der Erregerverteilung...)
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
a) Blut-Agar
b) Kochblut-Agar
c) MacConkey-Agar
d) evtl. Columbia-Agar mit Colistin und Nalidixinsäure
BURKHARDT:
a) Blut-Agar
+ Staph. aureus Impfstrich
+ Optochinplättchen
b) Kochblut-Agar
+ Plättchen mit Oleandomycin (15µg) oder Bacitracin (10 IE) im Grenzbereich Primär- und Sekundärausstrich
c) Lactose-Indikator-Nährböden (MacConkey, Drigalski, Endo ...)
d) evtl. Ansatz eines Hemmstofftestes zum Nachweis einer antibakteriellen Aktivität. Dieser gibt jedoch nur in Einzelfällen einen Hinweis für die Bewertung und hat nicht dieselbe Bedeutung wie bei Harnwegsinfekten.
e) Pilznährböden: (Sabouraud-Glukose-Agar, Kimming-Agar, Giozotia-Kreatinin-Nährboden....)
-bei vorausgehender längerer Antibiotikatherapie
-bei konkretem Mykoseverdacht
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Kulturmedien: 1.) Blutagarplatte 2.) Lactose-lndikator-Agarplatte (MacConkey, Endo ) 3.) Kochblut-Agar oder Hämophilussetektivagarplatte |
1.4.2. Verarbeitung
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Fraktionierter 3-Ösenausstrich:
Mit abgeflammter Öse wird eine punktförmige Beimpfung der ausgewählten Platte durchgeführt und im ersten Sektor der erste Ösenausstrich gemacht.
Nach Abflammen der Öse wird der 2. Ösenausstrich im 2. Sektor und nach neuerlichem Abflammen der 3. Ausstrich im 3. Sektor gemacht.
Inkubation:
Bei 36 ± 1°C:
a) Blut-Agar und Kochblut-Agar müssen in 5 -10 %iger CO2-Atmosphäre bebrütet werden.
b) andere Agarplatten können in 5 -10 %iger CO2 -Atmosphäre oder normaler Atmosphäre bebrütet werden.
c) Anaerobe Kultur bei Sputum ist nicht zielführend.
1.4.3. Bewertung und Interpretation:
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Die Kultur sollte nach dem 1. Tag (12- 18 Stunden) und am 2. Tag (48 Stunden) nach Anlegen der Probe abgelesen werden.
Eine semiquantitative Beurteilung ist ausreichend.
Ausnahme: bei eitrigen Patientenproben und Patienten mit zystischer Fibrose sollte nach entsprechender Homogenisierung eine quantitative Kultur durchgeführt werden.
Semiquantitative Bewertung des 3. Ösenausstriches
| Wachstum | Vorkommen | Bewertung |
| nur im 1. Impfstrich | gering | + |
| auch im 2. Impfstrich | mäßig | ++ |
| auch im 3. Impfstrich | reichlich | +++ |
CUMITECH (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology):
Die Kultur sollte nach dem ersten Tag (12-18) Stunden abgelesen werden. Eine neuerliche Ablesung nach 48 Stunden ist nur dann notwendig, wenn der Patient unter Antibiotikatherapie steht oder Organismen, die als Infektionserreger in Betracht kommen, noch nicht isoliert wurden, aber in der Gramfärbung ersichtlich waren.
Semiquantitative Bewertung
Anzahl der Kolonien in Ausstricharealen | |||
| Primär | Sekundär | Tertiär | |
| Grad | |||
| + | <10 | ||
| ++ | >10 | <5 | |
| +++ | >10 | >5 | <5 |
| ++++ | >10 | >5 | >5 |
Identifizierung, Protokollierung und Anlegen eines Antibiogramms nur bei vorherrschenden Organismen (= +++, ++++).
Die meisten Pathogene sind in Mengen von +++ bis ++++ vorhanden.
Ausnahme: Obligat pathogene Erreger oder spezielle Angaben des Klinikers.
Ob die Anwesenheit von vergrünenden Streptokokken, koagulasenegativen Staphylokokken erwähnt werden soll, wenn sie dominant erscheinen oder ob sie unter die normale Rachenflora subsummiert werden sollen, ist fraglich und stellt noch ein Problem dar.
Corynebakterien sind äußerst selten Erreger von Infektionen der tiefen Atemwege und müssen nicht identifiziert werden.
Ausnahme: wenn sie in der Gramfärbung dominant sind.
Enterobacteriaceae sind häufig Erreger bei hospitalisierten und abwehrgeschwächten Patienten, kaum jedoch Erreger bei ambulant erworbenen Pneumonien. Sie sind häufig als Kolonisationskeime des oberen Respirationstraktes bei Alkoholabusus, älteren Patienten und bei bestehender Antibiotikatherapie anzutreffen (cave: zu häufiges Isolieren und Protokollieren).
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
1) Kein möglicher pathogener Keim (Keime die mit Infektionen des unteren Respirationstraktes assoziiert sein können) vorhanden:
Bewertung als normale Flora des oberen Respirationstraktes.
2) Vorhandensein von einem oder zwei möglichen Pathogenen:
Semiquantifizierung, Identifizierung und Anlegen eines Antibiogramms; zusätzliche Semiquantifizierung der normalen Flora des oberen Respirationstraktes.
3) Vorhandensein von >2 möglichen Pathogenen:
Semiquantifizierung, Identifizierung und Antibiogramm von bis zu 2 dominanten möglichen pathogenen. Wenn keines der möglichen Pathogene vorherrschend ist, sollten sie semiquantifiziert und identifiziert werden. Zusätzlich Semiquantifizierung der normalen
Flora des Oropharyngealraumes.
4) Die Menge an möglichen Pathogenen ist > als die Menge der normalen Flora des oberen Respirationstraktes:
Ouantifizierung, Identifizierung und Antibiogramm von Organismen deren Menge mäßig bis reichlich ist, zusätzlich Angabe der Menge der normalen Oropharyngealflora.
5) Reinkultur eines Organismus, der Bestandteil der normalen Oropharyngealflora ist: Semiquantifizierung und Identifizierung.
DGHM (Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie):
Eine semiquantitative Beurteilung ist ausreichend.
Unterscheidung in:
– normale Standardflora: Semiquantifizierung
– obligat pathogene Erreger: Semiquantifizierung, Identifizierung und Anlegen eines Antibiogramms (unabhängig von der Menge).
– fakultativ pathogene Arten:
1) Je stärker ein Keim, der als Entzündungserreger in Betracht kommen kann, gegenüber der Oropharyngealflora in den Vordergrund tritt, desto wahrscheinlicher ist seine ätiologische Bedeutung.
2) Erreger die wiederholt nachgewiesen werden, auch wenn sie in geringe Mengen vorhanden sind, können Entzündungsursache sein.
3) Ätiologisch relevante Arten können hinter der Oropharyngealflora zurücktreten z.B. Nocardien.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Ein semiquantitative Bewertung der Keimzahl ist zu fordern. |
III. 2. Trachealsekret, Tubussekret
III.2.1. Gewinnung
Sekrete sollten unter Zuhilfenahme eines sterilen Katheters aus den tiefen Abschnitten des Bronchialbaumes aspiriert werden.
III.2.2. Makroskopische Untersuchung
Siehe Sputumuntersuchung
III.2.3. Mikroskopie
Siehe Sputumuntersuchung
III.2.4. Kultur
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Vorbereitung: Vermischung mittels Vortex für 1 Minute, evtl. Verflüssigung bei sehr zähen Sekreten (z. B. 1%-ige N-Acetyl-L-Cystein-Lösung oder Sputasol® zu gleichen Anteilen hinzufügen und 1 Minute gut mischen).
2.4.1. Kulturmedien
Basiskulturansatz und erweiterter Kulturansatz entspricht dem des Sputums.
2.4.2. Verarbeitung
Quantitative Kulturansätze werden bevorzugt
• Herstellen von Serienverdünnungen mit isotoner Kochsalzlösung (z. B. 1:100, 1: 10.000).
• Von der Originalsuspension werden 10µl auf die Agarplatten (Basisansatz) und von jeder Verdünnung ebenfalls jeweils 1µl ausgespatelt.
2.4.3. Bewertung und Interpretation
Die Ablesung der Kulturen erfolgt am 1. Tag (nach 12-18 Stunden) und am 2. Tag (ca. 48 Std.). Spezialkulturen werden je nach Selektivplatten bis zu 4 Wochen bebrütet.
Ermittlung der KBE /ml:
KBE/ml = die Zahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor x Inokulationsfaktor
Diagnositische Schwellwertkonzentrationen:
| Volumen | Diagnostische Schwellenkonzentration | ||
Bakterien | PE | Granulozyten | |
| >1ml | >= 10 5 - 10 6 KBE/ml | <10 | >25 |
Schwierigkeiten bei der Interpretation:
Die Besiedlung der Trachea mit oropharyngealer Flora oder Umgebungskeimen tritt nach Anlegen eines Trachealtubus / Tracheostomas relativ rasch ein (innerhalb 24 Std.). Zusätzlich kann auch durch die zelluläre Zusammensetzung des Materials kein eindeutiger zuverlässiger Rückschluss auf eine Infektion gezogen werden, da auch relativ rasch eine Entzündungsreaktion des Trachealepithels eintritt.
Tracheostoma:
Aspirate und Absaugungen sollten wie Sputum behandelt werden.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Es gelten die gleichen Erfordernisse wie bereits für Sputum beschrieben. Evtl. Flüssiganreicherungsmedium (bei bestimmten Indikationen). |
III.3. Bronchialsekret
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
III.3.1. Gewinnung
Die Aspiration des Bronchialsekrets erfolgt über den Arbeitskanal des Bronchoskops; evtl. vor der Aspiration instillieren einer geringen Menge einer isotonen Lösung, die keine antibakteriellen Zusätze enthält (Ringerlaktat ...)
Indikationen zur Bronchoskopie:
chronische Infekte, therapieresistente, hartnäckige Infekte
Immunkompromittierte Patienten
DD: Neoplasie oder Infektion?
V.a. Infektion mit Pneumocystis carinii
III.3.2. Makroskopische Untersuchung
Wie bei Sputum und Trachealsekret
III.3.3. Mikroskopische Untersuchung
Wie bei Sputum und Trachealsekret
III.3.4. Kultur
3.4.1. Kulturmedien
wie bei Sputum und Trachealsekret
3.4.2. Verarbeitung
quantitative Kulturansätze werden bevorzugt.
• Homogenisieren der Probe
• Herstellung von Serienverdünnungen
• Ausspateln von 100 µl der Originalsuspension und 100 µl der Verdünnungen auf Agarplatten (Basisansatz).
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Es gelten die gleichen Erfordernisse wie bereits für Sputum beschrieben. Evtl. Flüssiganreicherungsmedium. |
III.4. BAL(bronchoalvoläre Lavage)
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
III.4.1. Gewinnung
Absaugen der Sekrete des Naso-Oropharyngealraumes. Lokalanästhetikum sollte mittels Vernebler appliziert werden (anästhesierende Gele können antimikrobiell wirken!).
Einführen des Bronchoskops und instillieren von bis zu 160 ml isotoner Kochsalzlösung (mini BAL bis 30 ml). Mindestens 50 ml der instillierten Flüssigkeit sollten wiedergewonnen werden. Das erste Aspirat wird verworfen (Ausnahme: Suche nach obligat-pathogenen Erregern bei abwehrgeschwächten Patienten).
III.4.2. Mikroskopisch-zytologische Untersuchung
Bei BAL-Flüssigkeit sollte eine differentialzytologische Untersuchung durchgeführt werden.
Sie kann sowohl eine wertvolle Hilfe bei der Diagnostik von bakteriellen, viralen Infektionen, Pilzinfektionen und Infektionen mit Pneumocystis carinii sein, als auch differentialdiagnostische Hinweise auf nichtinfektiöse Lungenerkrankungen geben.
Zur Herstellung von zytologischen Präparaten sollte eine Zytozentrifuge verwendet werden.
Färbungen:
Gramfärbung
Methylenblaufärbung
Zusatzfärbungen: Färbung nach Giemsa bzw. nach Pappenheim (differentialzytologische Untersuchungen)
Interpretation der Färbungen:
• Plattenepithelien: > 1 % (bei 1000-facher Vergrößerung) an der Gesamtheit der nachweisbaren Zellen spricht für eine Kontamination mit oropharyngealer Flora
• Granulozyten: > 20% sind ein Hinweis auf eine Entzündung bzw. Infektion
• Lymphozyten: >10% kann auf eine Infektion durch Viren, Pilze oder Protozoen hinweisen
Zellverteilung in der BAL-Flüssigkeit ohne Infektion :
Alveolarmakrophagen: 96 ± 3 %
Lymphozyten: 3 ± 2%
Neutroph.Granulozyten: 1 ± 1 %
Eosinoph. Granulozyten: <1%
III.4.3. Kultur
4.3.1. Kulturmedien
a) Basiskulturansatz
b) Flüssiges. nicht selektives Nährmedium
(z. B.Hirn-Herz-Dextrose-Bouillon) zur Anreicherung von wenigen oder geschädigten Bakterien.
c) Anaerobe Kulturverfahren
nur bei Verdacht auf Aspirationspneumonie und nur mit quantitativer Kultur.
Laut amerikanischen Richtlinien ist BAL nicht geeignet für die Anaerobierkultur.
d) Spezialkulturen mit Selektivnährböden (für Candida, Schimmelpilze, Legionellen, Nocardien)
4.3.2. Verarbeitung
Ein quantitatives Kulturverfahren ist einzusetzen (Spezifität wird dadurch erhöht).
• Homogenisieren der Probe
• Serienverdünnung mit isotoner Kochsalzlösung
• 100 µl der Originalsuspension und 100 µl von jeder Verdünnung werden auf Agarplatten gleichmäßig ausgespatelt.
4.3.3. Beurteilung
Ablesung nach 12-18 stündiger und 48 stündiger Bebrütung. Spezialkulturen werden je nach Selektivplatten bis zu 4 Wochen bebrütet.
Ermittlung der KBE/ml.
• >10 4 KBE gelten als diagnostisch aussagekräftig für eine Pneumonie.
• nach antibiotischer Therapie kann auch ein potentiell pathogener Erreger in niedriger Konzentration von Bedeutung sein.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Mikroskopie des BAL-Sedimentes: • Gramfärbung • Zusätzliche Färbungen je nach klinischen Angaben • (z.B. Cafcofluor-White-Färbung für Pilze und Pneumocystis carinii, ZN für säurefeste Stäbchen) Kultur der Originalsuspension (evtl.+ Sediment): |
III.5. Geschützte Bürste (protected specimen brush = PSB)
MIQ (Mikroskopisch-Infektiologische Qualitätsstandards):
III.5.1. Gewinnung
Eine von zwei Teleskopkathetern umhüllte Bronchialbürste wird durch den Arbeitskanal des Bronchoskops eingeführt. Der innere Katheter wird vorgeschoben und anschließend die Bürste mittels Führungsdraht aus dem inneren Katheter an die geeignete Stelle herausgeschoben. Nach "Bürsten" der besagten Stelle wird die Bürste in den inneren Katheter zurückgezogen, der innere Katheter in den äußeren.
Vorteil: Kontaminationsarme Probengewinnung
Häufig eindeutig diagnostische Aussage möglich
Gelegentlich das beste, verfügbare Untersuchungsmaterial (v.a. bei Beatmungspneumonien).
Nachteil: Geringe Probenmenge (0,001 -0,01 ml)
III.5.2. Mikroskopische Untersuchung
5.2.1. mikroskopisch zytologische Untersuchung:
wie bei BAL
III.5.3. Kultur
5.3.1. Kulturmedien
MIQ (Mikroskopisch-Infektiologische Qualitätsstandards):
wie bei BAL
EPCM (Essential Procedures für Clinical Microbiology):
anaerobe Kultur nur nach Anfrage
CUMITECH (Cumulative Techniaues and Procedures in Clinical Microbiology):
aerobe und anaerobe Kultur
5.3.2. Verarbeitung
MIQ (Mikrobiologisch-Infektiologische Oualitätsstandards):
Die Bürste wird in 1 ml Bouillon (Ringerlaktatlösung) 1 min. lang gut gemischt. Die Verdünnung der Probe beträgt ca 10-³ bei einer Probenmenge von 0,001 ml. Herstellen von Serienverdünnungen und Ausspateln von 100 µl Originalsuspension und 100 µl jeder Verdünnung.
EPCM (Essential Procedures for Clinical Microbiology):
Die Bürste wird in 1ml steriler Kochsalzlösung oder BHI-Bouillon gemischt und anschließend 10 µl auf Platten ausgespatelt.
KBE/ml: Anzahl der Kolonien / Platte x Verdünnungsfaktor
5.3.3. Beurteilung
Grenzwerte von >= 10³ KBE/ml gelten als diagnostisch aussagekräftig für das Vorliegen einer Pneumonie.
III.6. Transtracheales Aspirat (TTA)
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Oualitätsstandards):
Vorteil:
Kontaminationsfreie Probengewinnung,
alle Mikroorganismen sind als Entzündungserreger zu werten
Gutes Material für Anaerobierkultivierung
Nachteil:
Belastung des Patienten
Komplikationen und Nebenwirkungen
Ausreichende Übung und Erfahrung des durchführenden Arztes ist notwendig
Dieses Verfahren wird heute kaum mehr durchgeführt.
III.7. Lungenbiopsie
Vorteil:
Bestes Untersuchungsmaterial,
keine Kontamination mit oropharyngealer Flora
Nachteil:
Narkose und Operationsrisiko
Indikation:
Wenn alle anderen diagnostischen Verfahren ausgeschöpft sind.
III.7.1. Transport
Biopsate sollten nativ (evtl. in physiologischer Kochsalzlösung) unverzüglich ins Labor transportiert werden.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Kultur: 1) Basiskulturansatz: • bluthaltiges Agarmedium • kochbluthaltiges Agarmedium • Lactose-Indikator-Agar 2) Spezialisierte Kulturen: • Selektivmedien für Pilze • Legionellen • Nocardien 3) Flüssiges nichtselektives Anreicherungsmedium 4) Anaerobes Kultivierungsverfahren: ist o b l i g a t Beurteilung: Alle Mikroorganismen sollen identifiziert und ein Antibiogramm angelegt werden |
III.8. Transthorakale Feinnadelpunktion
Vorteil:
Keine Kontamination mit oropharyngealer Flora
Geeignetes Material für Anaerobierkultivierung
Nachteil:
Komplikationen: Pneumothorax, Blutungen,
Indikation, Mikroskopie, Transport, Kultur und Beurteilung wie bei offener Lungenbiopsie.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Mikroskopie: Kultur: |
III.9. Pleuraflüssigkeit
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Oualitätsstandards):
Bei bestehendem Pleuraerguss oder -empyem ist der Nachweis von Erregern von großer diagnostischer Bedeutung.
III.9.1. Mikroskopie
Mindestanforderung: Gramfärbung
III.9.2. Transport
Pleuraflüssigkeit kann in der zur Punktion verwendeten Spritze versandt werden. Bei Verdacht auf Anaerobier kann alternativ ein Anaerobiertransportmedium verwendet werden. Zusätzlich kann ein Flüssigmedium (Blutkulturmedium) beimpft werden.
III.9.3. Kultur
9.3.1. Kulturmedien
a) Basiskulturansatz
b) Flüssiges nichtselektives Anreicherungsmedium
c) Anaerobes Kultivierungsverfahren
d) Spezialkultur mit Selektivmedien bei gezielter Fragestellung
e) Kultur auf Mykobakterien
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Mikroskopie: Eine mikroskopische Untersuchung wird nicht routinemäßig gefordert Kultur: |
III.10. Blutkultur
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Blutkulturen sind obligat bei allen schwerverlaufenden Pneumonien
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
Blutkulturen sollten immer bei Patienten mit Pneumonien angelegt werden.
IV.1. Anaerobier
Erregerspektrum: alle potentiell pathogenen, sporenlosen, anaeroben Bakterien die hauptsächlich aus dem Oropharynx stammen (Prevotella, Fusobakterien, Peptostreptokokken). Meistens besteht eine Mischinfektion mit aeroben Bakterien und manchmal Sprosspilzen.
IV.1.1. Transport
Der Transport sollte möglichst rasch erfolgen evtl. unter Verwendung von geeigneten Transportmedien.
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
IV.1.2. Kultur
Kulturmedien
- Glukose-Hefeextrakt-Cystein Agar (z. B.Schädler-Agar) + zusätzlich ein selektiver Agar
z. B Schädler-Agar mit Antibiotikazusatz)
- Bebrütung: 48 Stunden bei 36°C in anaerober Atmosphäre
zusätzlich sollte eine 2. anaerobe Kultur für langsamwachsende Keime angelegt werden.
Bebrütung: mindestens 4 Tage
evtl. anaerobe Anreicherungskultur
IV.2. Legionellen
Legionellen sind wichtige Erreger sowohl ambulant erworbener als auch nosokomialer Pneumonien. Am häufigsten wird Legionella pneumophila (14 Serogruppen) isoliert.
Ca. 75-85% der Infektionen werden durch Legionella pneumophila der Serogruppe 1 hervorgerufen.
Risikofaktoren: vorbestehende Lungenschädigung, Corticosteroidtherapie, Tumorerkrankungen, Immunsuppression (z. B. nach Transplantationen), Diabetes mellitus, Rauchen und Auslandsaufenthalte.
Übertragung: erfolgt über Aerosolinhalation, Aspiration
Die klinische Manifestation ist abhängig von der Immunitätslage der Patienten und von der Inokulumsmenge.
Indikationen zur Legionellendiagnostik:
• Alle ambulant erworbenen schweren Pneumonien
• Anamnestischer und klinischer Verdacht auf eine Legionelleninfektion (Auslandsaufenthalte, erfolglose Behandlung mit ß-Laktam-Antibiotika, ZNS-Symptome, Z.n. Transplantationen)
IV.2.1. Untersuchungsmaterial
• Alle Sekrete des unteren Respirationstraktes einschließlich Sputum
Kontaminierte Materialien könnten mit Hitze oder Säure vorbehandelt werden
• Pleurapunktate
• Biopsiematerial
• Urin: Antigennachweis
Hitzebehandlung: Zuvor verdünnte oder suspendierte Probe 30 min. im Wasserbad bei 50°C stehen lassen.
Säurebehandlung: Probe 1:10 mit KCI-HCI-Puffer, pH 2,2 verdünnen und 5 min. bei Zimmertemperatur stehen lassen.
IV.2.2. Transport
Der Transport erfolgt in sterilem Gefäß, gut verschlossen und vor Austrocknung geschützt (evtl. 1 ml Nährbouillon). Die Probe sollte ehestbaldig nach Gewinnung ins Labor gelangen.
IV.2.3. Mikroskopie
• DFA (direct immunfluorescence assay)
Vorteil: Schneller Erregernachweis
Mit monoklonalen Antikörpern gegen ein Membranprotein von Legionella pneumophila liegt die Spezifität bei >99%.
Nachteil: relativ niedrige Sensitivität 33-70 %
Positives Ergebnis erst ab einer Erregerdichte von >10 4/ml.
• Gramfärbung: mit 0,1%iger basischer Fuchsinlösung (Safranin färbt Bakterien nur schwach).
Nachteil: Legionellen sind von anderen gramnegativen Stäbchen nicht eindeutig zu unterscheiden.
• Silberfärbung und Giemsafärbung: für Gewebe
• (Säurefeste Färbung für Legionella micdadei: Gewebe, evtl. Sputum)
IV.2.4. Kultur
2.4.1. Vorbereitung
Sputum, Tracheobronchialsekret: werden mit Trypticase-Soja-Bouillon oder anderen kochsalzarmen Medien 1:10 verdünnt, durch Schütteln homogenisiert und einige Tropfen dieser Dilution auf die Platten aufgebracht.
BAL: zentrifugieren und wie oben verdünnen.
Punktate: Sediment wird nach Zentrifugieren unverdünnt ausgestrichen.
Gewebeproben: werden mit der Verdünnungslösung in einem geschlossenen Homogenisator zerkleinert und vor der Verimpfung neu verdünnt.
2.4.2. Kulturmedien
zur Anzucht von Legionellen sind L-Cystein-und eisenhaltige Medien notwendig
a) BCYE-Agar
b) BCYE-Aaarbasis + Antimikrobielle Substanzen als Zusätze zur Hemmung der Begleitflora:
z. B. BMPAa: mit Polymyxin B, Anisomycin, Cefamandol MWY-Agar (Medium nach Wadowski und Yee): mit Polymixin B, Anisomycin, Vancomycin
2.4.3. Inkubation, Bewertung
Die Inkubation erfolgt bei 36 °C (35 -37°C) und einer Luftfeuchtigkeit von 90- 95% (80- 90%). Nach 2-5 Tagen sind typische Kolonieformen zu erkennen, die Bebrütungsdauer beträgt bis 14 Tage.
Identifizierung: DFA oder Bakterienagglutination mit spezifischen Antiseren.
Unfähigkeit auf cysteinfreien Nährböden zu wachsen.
2.5. Antigennachweis im Urin
Der Antigennachweis mittels ELISA oder Latexüberwanderungstest ist ein geeigneter Parameter für die Akutdiagnostik (Sensitivität 80 %, Spezifität 99%).
Zu Beginn der Erkrankung ist ein hitzestabiles, lösliches Antigen nachweisbar.
Es sollten mindestens je 5 ml Urin an 2 aufeinanderfolgenden Tagen eingesandt werden.
2.6. Antikörpernachweis
Der Antikörpernachweis ist für die Akutdiagnostik nicht geeignet.
Methoden der Wahl zum Nachweis von Legionellen
• Antigennachweis im Urin
• Kultur (möglichst 2 Proben)
• DFA mit monoklonalen AK (möglichst 2 Proben)
IV.3. Nocardien
Humanpathogene Nocardien gehören nicht zur Normalflora des Menschen. Sie kommen im Erdboden und Oberflächengewässer vor. Die Infektion erfolgt exogen, häufig auf der Basis einer Primärschädigung. 40-60% (85%) der Patienten mit Nocardieninfektionen leiden unter prädisponierenden Grundkrankheiten (Leukämie, Neoplasien, AIDS, Morbus Cushing, chronische Lungenaffektionen, Immunsuppressive Therapie, zytostatische Therapie).
Klinik: Die klinische Manifestation verläuft unter dem Bild einer akuten, teilweise fulminant diffus nekrotisierenden oder chronischen Pneumonie und kann zu Abszeß-, Empyem- und Kavernenbildung führen. Eine systemische Ausbreitung (per continuitatem) ist möglich.
IV.3.1.Untersuchungsmaterial
• Sputum
• Bronchoskopisch gewonnenes Material (bevorzugt)
• Lungenbiopsiematerial: bei klinischem Verdacht und wiederholt negativem Befund
• (Transthorakales Abszeßpunktatmaterial)
Zur Abgrenzung einer Kontamination (Anflugkeim) und evtl. diskontinuierlicher Ausscheidung sind mehrere zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Proben zu untersuchen.
IV.3.2. Transport
Ein rascher Transport ist erforderlich.
IV.3.3. Mikroskopie
• Gramfärbung: flüssige Proben sollten vorher zentrifugiert werden (evtl. modifizierte Gramfärbung nach Weigert für Gewebe).
• Methylenblaufärbung: (1%ige Methylenblaulösung):
körniges Material sollte bei schwacher Vergrößerung auf drusenähnliche Strukturen untersucht werden.
• Säurefeste Färbung: Die Differenzierung sollte mit Schwefelsäure (1%ig) ohne Alkohol erfolgen. Die Säurefestigkeit ist unregelmäßig.
Z.B. modifizierte ZN-Färbung
IV.3.4. Kultur
3.4.1. Kulturmedien
Nocardien wachsen im Prinzip auf allen Universalnährböden unter aeroben Bedingungen.
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
1) Nichtkontaminiertes Material:
z. B. Sabouraud-Glukose-Agar, DST-Agar (Diagnostic-Sensitivity-Test-Agar) BHI-Agar mit oder ohne Blutzusatz bzw. entsprechende Bouillonen.
Transparente Medien sind vorzuziehen, da bereits nach 1 -2 Tagen von der Unterseite eine mikroskopische Untersuchung (bei 100-facher Vergrößerung) möglich ist.
2) Kontaminierte / Orooharvnaealflora enthaltende Proben erfordern selektive Spezialverfahren: z. B. Nocardiaselektivagar nach Schaal und Heimerzheim, Löwenstein-Jensen-Agar, Clauberg-III-Medium, Paraffin-Köder-Methode nach Gordon und Hagan.
Inkubation: aerob bei 25- 30°C und 36°C
Bebrütungsdauer: 2- 3 Wochen
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
1) Routinemedien (durch langsames Wachstum kann es zu Überwucherung durch andere Keime bei kontaminierten Proben kommen)
2) Paraffin-Köder-Methode
3) andere Festmedien mit Paraffin als einzige Kohlenstoffquelle
4) BHI-Agar und Sabouraud-Glukose-Agar
5) Mykobakterielle Kulturmedien
6) BCYE-Agar: Sputum in KCl-HCl-1:10 verdünnen (pH 2,2), schütteln, ca. 10 min. stehen lassen und anschließend kultivieren. Kolonien werden ab dem 3. Tag sichtbar. Die Bebrütungsdauer sollte bis zu 30 Tage betragen.
Zumindest ein Medium sollte bei 45°C bebrütet werden: höhere Nachweiswahrscheinlichkeit für Nocardia asteroides.
CUMITECH: (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology):
1) Pilzmedien
2) Kulturmedien für Mvkobakterien (ohne antimikrobielle Zusätze)
3) Blutplatten, die sonst für Sputumkultur verwendet werden. Auf Grund langsamen Wachstums ist jedoch eine längere Bebrütungsdauer notwendig.
EPCM: (Essential Procedures for Clinical Microbiology)
1) Routinemedien: Blutagarplatten mit 5% Schafblutagar
Sabouraud-Glukose-Agar
BHI-Agar
2) Selektivmedien: BHI-Agar mit Chloramphenicol und Cycloheximid
Columbia-Agar mit Colistin und Nalidixinsäure
3) Mykobakt. Medien: Löwenstein-Jensen
Middlebrook 7H 10 oder 7H 11
Selektivmiddlebrook 7H10 oder 7H11
4) Definierte Medien die Paraffin und/oder Gelatine als einzige Kohlenstoffquelle enthalten.
Die Inkubation erfolgt aerob bei 30°C Bebrütungsdauer:
14-21 Tage Kontrolle auf Wachstum alle 3-4 Tage
IV.3.5.ldentifizierung
Die Verdachtsdiagnose auf Nocardien sollte in Routinelabors möglich sein. Die Speziesdifferenzierung erfolgt in spezialisierten Laboratorien.
Kriterien:
• Obligat aerobes Wachstum
• Partielle Säurefestigkeit
• Katalaseaktivität
• Ureaseaktivität
• Wachstum bei 42°C
• Lysozymresistenz: mittels Lysozym-Bouillon- Test (kommerziell erhältlich)
• Nitratreduktaseaktivität: Medium nach Schaal
• Hydrolysetest: Medien nach Gordon, Gordon und Smith
Lysozym-Bouillon-Test: Bestandteile:
1) Glycerol-Bouillon ohne Lysozym,
2) Glycerol-Bouillon mit Lysozym,
3) Positiv-Kontrolle (ATCC-Stamm von Nocardia asteroides),
4) Negativ Kontrolle (ATCC-Stamm von Streptomyces).
Inkubation bei 30°C, wöchentliche Kontrolle über 4 Wochen (MIQ 14-20 Tage)
Bewertung: Nocardien wachsen in 1) und 2),
Streptomyces oder andere Actinomyceten nur in 1).
Hydrolyse-Test: Beruht auf der Hydrolyse wasserunlöslicher Verbindungen wie Casein, Tyrosin, Xanthin und Hypoxanthin in einem Agarmedium.
Bewertung: positive Reaktion: Bildung einer Klärzone unter dem Koloniewachstum und im Umgebungsmedium.
Paraffin-Köder-Methode:
In ein Reagenzglas wird ein kohlenhydratfreies Basalmedium eingefüllt und anschließend ein ca. 3 cm langes mit sterilem Paraffin beschichtetes Glasstäbchen bis zur Hälfte in das Basalmedium eingetaucht.
Mikroben, die Paraffin als alleinige C und Energiequelle verwerten können, wachsen auf der Paraffinschicht. Ein creme- bis orangefarbener oder samtartig weißer Belag in Höhe des Flüssigkeitsspiegels zeigt nach ein- bis dreiwöchiger Bebrütung Nocardienwachstum an. Vom Wachstumsgürtel wird mit der Impfnadel durch Abschaben eine Subkultur auf den oben beschriebenen Medien angelegt.
Sputum sollte vorher 1:1 mit gepufferter Kochsalzlösung verdünnt werden und anschließend in das flüssige, kohlenhydratfreie Basalmedium eingebracht werden.
IV.4. Pneumocystis carinii
Pneumocystis carinii ist ein ubiquitär vorkommender Erreger von interstitiellen Pneumonien, der weltweit in der Lunge einer Vielzahl von gesunden Wirten (v.a. Nager) auftritt, sich aber nur bei Immunschwäche als sogenannter opportunistischer Parasit explosionsartig
vermehrt.
Wurde der Erreger der Pneumozystose bisher eher zu den Protozoen gerechnet (Struktur der Mitochondrien, Kerne, Golgi Apparat und Teilungsvorgänge), weisen die Untersuchungen der RNA-Sequenzen auf eine Verwandtschaft zu Pilzen hin. Die systematische Stellung
ist derzeit noch unklar.
Übertragung: aerogen (kontaminierter Staubpartikel und Tröpfcheninfektion)
Inkubationszeit: nicht genau bekannt. Die Literaturangaben reichen von einer Woche bis zu 4-8 Wochen in Abhängigkeit von der
aufgenommenen Erregermenge.
Symptome: Fieber, Dyspnoe, Tachypnoe, Tachycardie, Zyanose, unproduktiver Husten und gelegentlich retrosternale Schmerzen.
Es werden sowohl schleichende, mit lange bestehenden uncharakteristischen Symptomen als auch akut fulminante Verlaufsform beschrieben.
Meistens ist der Auskultationsbefund unauffällig.
Befunde: Leukozyten können normal bis erhöht sein, mögliche Eosinophilie. Es besteht typischerweise eine Diskrepanz zwischen Schwere des klinischen Bildes und der verzögerten Ausprägung des röntgenologischen Befundes (doppelseitige, perihilär besonders ausgeprägte
diffuse Infiltrate).
IV.4.1.Untersuchungsmaterial
Das Untersuchungsgut muß Alveolarmaterial enthalten.
• Am besten geeignet ist: BAL-Flüssigkeit (mindestens 10 ml)
• (bedingt) geeignet: induziertes Sputum (HIV-Patienten)
Tracheal- und Bronchialsekret von Kleinkindern
• nicht geeignet: Sputum
IV.4.2. Mikroskopie
Vorbereitung: zentrifugieren (1600 x g für 5 min.) und das Sediment auf mehrere Objektträger auftragen, lufttrocknen und mit Methanol fixieren.
Zähflüssige Materialien sollten vorher 1:1 mit einer 0,1 %igen Dithiothreitol-Lösung versetzt und 15 min. bei Zimmertemperatur verflüssigt werden.
• Giemsa-Färbung: Darstellung von Trophozoiten und intrazystischen Körperchen. Plasma wird blau gefärbt, Kerne rot. Die Zystenwand bleibt ungefärbt. Positive und negative Kontrollpräparate sollten mitgeführt werden.
• Grocott-Gomori-Methenamin-Silberfärbung: Darstellung von Zysten. Die Zysten erscheinen braun-schwarz gefärbt und weisen typische Wandverdickungen auf (ähnlich dem Spalt einer Kaffeebohne).
Positive und negative Kontrollpräparate sollten mitgeführt werden.
• Toluidinblaufärbung: diese Färbung ist jedoch wenig prägnant und schwer zu deuten. Darstellung von Zysten.
• Calcofluor white Färbung: Darstellung von Zysten
• Direkte Immunfluoreszenz: stellt Zysten eindeutig dar (besonders bei geringer Erregermenge von Vorteil).
IV.5. Zystische Fibrose
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Homogenisieren und Verdünnen der Probe (1:100 und 1:10.000)
Kulturmedien:
a) 3 Platten mit bluthaltigem Agarmedium
b) 1 Kochblutagarplatte
c) 1 Lactose-lndikator-Agarglatte
d) 2-3 Pilzplatten (verschiedene Temperaturen und Inkubationszeiten)
e) 1 Selektivplatte für Staph. aureus
f) 1 Ticarcillin-Platte
a)- f) routinemäßig
g) weitere Medien bei spezieller Indikation
h) Flüssigmedium ?
Bebrütung: insgesamt 48 Stunden
Erregerspektrum: alle potentiell pathogenen, sporenlosen, anaeroben Bakterien die hauptsächlich aus dem Oropharynx stammen (Prevotella, Fusobakterien, Peptostreptokokken). Meistens besteht eine Mischinfektion mit aeroben Bakterien und manchmal Sprosspilzen.
IV.1.1. Transport
Der Transport sollte möglichst rasch erfolgen evtl. unter Verwendung von geeigneten Transportmedien.
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
IV.1.2. Kultur
Kulturmedien
- Glukose-Hefeextrakt-Cystein Agar (z. B.Schädler-Agar) + zusätzlich ein selektiver Agar
z. B Schädler-Agar mit Antibiotikazusatz)
- Bebrütung: 48 Stunden bei 36°C in anaerober Atmosphäre
zusätzlich sollte eine 2. anaerobe Kultur für langsamwachsende Keime angelegt werden.
Bebrütung: mindestens 4 Tage
evtl. anaerobe Anreicherungskultur
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Kultur: 1) Anaerobierplatte: Bebrütung 48 h bei 36°C 2) Flüssigmedium |
IV.2. Legionellen
Legionellen sind wichtige Erreger sowohl ambulant erworbener als auch nosokomialer Pneumonien. Am häufigsten wird Legionella pneumophila (14 Serogruppen) isoliert.
Ca. 75-85% der Infektionen werden durch Legionella pneumophila der Serogruppe 1 hervorgerufen.
Risikofaktoren: vorbestehende Lungenschädigung, Corticosteroidtherapie, Tumorerkrankungen, Immunsuppression (z. B. nach Transplantationen), Diabetes mellitus, Rauchen und Auslandsaufenthalte.
Übertragung: erfolgt über Aerosolinhalation, Aspiration
Die klinische Manifestation ist abhängig von der Immunitätslage der Patienten und von der Inokulumsmenge.
Indikationen zur Legionellendiagnostik:
• Alle ambulant erworbenen schweren Pneumonien
• Anamnestischer und klinischer Verdacht auf eine Legionelleninfektion (Auslandsaufenthalte, erfolglose Behandlung mit ß-Laktam-Antibiotika, ZNS-Symptome, Z.n. Transplantationen)
IV.2.1. Untersuchungsmaterial
• Alle Sekrete des unteren Respirationstraktes einschließlich Sputum
Kontaminierte Materialien könnten mit Hitze oder Säure vorbehandelt werden
• Pleurapunktate
• Biopsiematerial
• Urin: Antigennachweis
Hitzebehandlung: Zuvor verdünnte oder suspendierte Probe 30 min. im Wasserbad bei 50°C stehen lassen.
Säurebehandlung: Probe 1:10 mit KCI-HCI-Puffer, pH 2,2 verdünnen und 5 min. bei Zimmertemperatur stehen lassen.
IV.2.2. Transport
Der Transport erfolgt in sterilem Gefäß, gut verschlossen und vor Austrocknung geschützt (evtl. 1 ml Nährbouillon). Die Probe sollte ehestbaldig nach Gewinnung ins Labor gelangen.
IV.2.3. Mikroskopie
• DFA (direct immunfluorescence assay)
Vorteil: Schneller Erregernachweis
Mit monoklonalen Antikörpern gegen ein Membranprotein von Legionella pneumophila liegt die Spezifität bei >99%.
Nachteil: relativ niedrige Sensitivität 33-70 %
Positives Ergebnis erst ab einer Erregerdichte von >10 4/ml.
• Gramfärbung: mit 0,1%iger basischer Fuchsinlösung (Safranin färbt Bakterien nur schwach).
Nachteil: Legionellen sind von anderen gramnegativen Stäbchen nicht eindeutig zu unterscheiden.
• Silberfärbung und Giemsafärbung: für Gewebe
• (Säurefeste Färbung für Legionella micdadei: Gewebe, evtl. Sputum)
IV.2.4. Kultur
2.4.1. Vorbereitung
Sputum, Tracheobronchialsekret: werden mit Trypticase-Soja-Bouillon oder anderen kochsalzarmen Medien 1:10 verdünnt, durch Schütteln homogenisiert und einige Tropfen dieser Dilution auf die Platten aufgebracht.
BAL: zentrifugieren und wie oben verdünnen.
Punktate: Sediment wird nach Zentrifugieren unverdünnt ausgestrichen.
Gewebeproben: werden mit der Verdünnungslösung in einem geschlossenen Homogenisator zerkleinert und vor der Verimpfung neu verdünnt.
2.4.2. Kulturmedien
zur Anzucht von Legionellen sind L-Cystein-und eisenhaltige Medien notwendig
a) BCYE-Agar
b) BCYE-Aaarbasis + Antimikrobielle Substanzen als Zusätze zur Hemmung der Begleitflora:
z. B. BMPAa: mit Polymyxin B, Anisomycin, Cefamandol MWY-Agar (Medium nach Wadowski und Yee): mit Polymixin B, Anisomycin, Vancomycin
2.4.3. Inkubation, Bewertung
Die Inkubation erfolgt bei 36 °C (35 -37°C) und einer Luftfeuchtigkeit von 90- 95% (80- 90%). Nach 2-5 Tagen sind typische Kolonieformen zu erkennen, die Bebrütungsdauer beträgt bis 14 Tage.
Identifizierung: DFA oder Bakterienagglutination mit spezifischen Antiseren.
Unfähigkeit auf cysteinfreien Nährböden zu wachsen.
2.5. Antigennachweis im Urin
Der Antigennachweis mittels ELISA oder Latexüberwanderungstest ist ein geeigneter Parameter für die Akutdiagnostik (Sensitivität 80 %, Spezifität 99%).
Zu Beginn der Erkrankung ist ein hitzestabiles, lösliches Antigen nachweisbar.
Es sollten mindestens je 5 ml Urin an 2 aufeinanderfolgenden Tagen eingesandt werden.
2.6. Antikörpernachweis
Der Antikörpernachweis ist für die Akutdiagnostik nicht geeignet.
Methoden der Wahl zum Nachweis von Legionellen
• Antigennachweis im Urin
• Kultur (möglichst 2 Proben)
• DFA mit monoklonalen AK (möglichst 2 Proben)
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Diagnostik festgelegt: Legionellendiagnostik: Be1 allen BAL, Biopsien und Punktionen von Pneumoniepatienten auch ohne spezielle Anforderung. |
IV.3. Nocardien
Humanpathogene Nocardien gehören nicht zur Normalflora des Menschen. Sie kommen im Erdboden und Oberflächengewässer vor. Die Infektion erfolgt exogen, häufig auf der Basis einer Primärschädigung. 40-60% (85%) der Patienten mit Nocardieninfektionen leiden unter prädisponierenden Grundkrankheiten (Leukämie, Neoplasien, AIDS, Morbus Cushing, chronische Lungenaffektionen, Immunsuppressive Therapie, zytostatische Therapie).
Klinik: Die klinische Manifestation verläuft unter dem Bild einer akuten, teilweise fulminant diffus nekrotisierenden oder chronischen Pneumonie und kann zu Abszeß-, Empyem- und Kavernenbildung führen. Eine systemische Ausbreitung (per continuitatem) ist möglich.
IV.3.1.Untersuchungsmaterial
• Sputum
• Bronchoskopisch gewonnenes Material (bevorzugt)
• Lungenbiopsiematerial: bei klinischem Verdacht und wiederholt negativem Befund
• (Transthorakales Abszeßpunktatmaterial)
Zur Abgrenzung einer Kontamination (Anflugkeim) und evtl. diskontinuierlicher Ausscheidung sind mehrere zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Proben zu untersuchen.
IV.3.2. Transport
Ein rascher Transport ist erforderlich.
IV.3.3. Mikroskopie
• Gramfärbung: flüssige Proben sollten vorher zentrifugiert werden (evtl. modifizierte Gramfärbung nach Weigert für Gewebe).
• Methylenblaufärbung: (1%ige Methylenblaulösung):
körniges Material sollte bei schwacher Vergrößerung auf drusenähnliche Strukturen untersucht werden.
• Säurefeste Färbung: Die Differenzierung sollte mit Schwefelsäure (1%ig) ohne Alkohol erfolgen. Die Säurefestigkeit ist unregelmäßig.
Z.B. modifizierte ZN-Färbung
IV.3.4. Kultur
3.4.1. Kulturmedien
Nocardien wachsen im Prinzip auf allen Universalnährböden unter aeroben Bedingungen.
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
1) Nichtkontaminiertes Material:
z. B. Sabouraud-Glukose-Agar, DST-Agar (Diagnostic-Sensitivity-Test-Agar) BHI-Agar mit oder ohne Blutzusatz bzw. entsprechende Bouillonen.
Transparente Medien sind vorzuziehen, da bereits nach 1 -2 Tagen von der Unterseite eine mikroskopische Untersuchung (bei 100-facher Vergrößerung) möglich ist.
2) Kontaminierte / Orooharvnaealflora enthaltende Proben erfordern selektive Spezialverfahren: z. B. Nocardiaselektivagar nach Schaal und Heimerzheim, Löwenstein-Jensen-Agar, Clauberg-III-Medium, Paraffin-Köder-Methode nach Gordon und Hagan.
Inkubation: aerob bei 25- 30°C und 36°C
Bebrütungsdauer: 2- 3 Wochen
BAILEY & SCOTT's Diagnostic Microbiology:
1) Routinemedien (durch langsames Wachstum kann es zu Überwucherung durch andere Keime bei kontaminierten Proben kommen)
2) Paraffin-Köder-Methode
3) andere Festmedien mit Paraffin als einzige Kohlenstoffquelle
4) BHI-Agar und Sabouraud-Glukose-Agar
5) Mykobakterielle Kulturmedien
6) BCYE-Agar: Sputum in KCl-HCl-1:10 verdünnen (pH 2,2), schütteln, ca. 10 min. stehen lassen und anschließend kultivieren. Kolonien werden ab dem 3. Tag sichtbar. Die Bebrütungsdauer sollte bis zu 30 Tage betragen.
Zumindest ein Medium sollte bei 45°C bebrütet werden: höhere Nachweiswahrscheinlichkeit für Nocardia asteroides.
CUMITECH: (Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology):
1) Pilzmedien
2) Kulturmedien für Mvkobakterien (ohne antimikrobielle Zusätze)
3) Blutplatten, die sonst für Sputumkultur verwendet werden. Auf Grund langsamen Wachstums ist jedoch eine längere Bebrütungsdauer notwendig.
EPCM: (Essential Procedures for Clinical Microbiology)
1) Routinemedien: Blutagarplatten mit 5% Schafblutagar
Sabouraud-Glukose-Agar
BHI-Agar
2) Selektivmedien: BHI-Agar mit Chloramphenicol und Cycloheximid
Columbia-Agar mit Colistin und Nalidixinsäure
3) Mykobakt. Medien: Löwenstein-Jensen
Middlebrook 7H 10 oder 7H 11
Selektivmiddlebrook 7H10 oder 7H11
4) Definierte Medien die Paraffin und/oder Gelatine als einzige Kohlenstoffquelle enthalten.
Die Inkubation erfolgt aerob bei 30°C Bebrütungsdauer:
14-21 Tage Kontrolle auf Wachstum alle 3-4 Tage
IV.3.5.ldentifizierung
Die Verdachtsdiagnose auf Nocardien sollte in Routinelabors möglich sein. Die Speziesdifferenzierung erfolgt in spezialisierten Laboratorien.
Kriterien:
• Obligat aerobes Wachstum
• Partielle Säurefestigkeit
• Katalaseaktivität
• Ureaseaktivität
• Wachstum bei 42°C
• Lysozymresistenz: mittels Lysozym-Bouillon- Test (kommerziell erhältlich)
• Nitratreduktaseaktivität: Medium nach Schaal
• Hydrolysetest: Medien nach Gordon, Gordon und Smith
Lysozym-Bouillon-Test: Bestandteile:
1) Glycerol-Bouillon ohne Lysozym,
2) Glycerol-Bouillon mit Lysozym,
3) Positiv-Kontrolle (ATCC-Stamm von Nocardia asteroides),
4) Negativ Kontrolle (ATCC-Stamm von Streptomyces).
Inkubation bei 30°C, wöchentliche Kontrolle über 4 Wochen (MIQ 14-20 Tage)
Bewertung: Nocardien wachsen in 1) und 2),
Streptomyces oder andere Actinomyceten nur in 1).
Hydrolyse-Test: Beruht auf der Hydrolyse wasserunlöslicher Verbindungen wie Casein, Tyrosin, Xanthin und Hypoxanthin in einem Agarmedium.
Bewertung: positive Reaktion: Bildung einer Klärzone unter dem Koloniewachstum und im Umgebungsmedium.
Paraffin-Köder-Methode:
In ein Reagenzglas wird ein kohlenhydratfreies Basalmedium eingefüllt und anschließend ein ca. 3 cm langes mit sterilem Paraffin beschichtetes Glasstäbchen bis zur Hälfte in das Basalmedium eingetaucht.
Mikroben, die Paraffin als alleinige C und Energiequelle verwerten können, wachsen auf der Paraffinschicht. Ein creme- bis orangefarbener oder samtartig weißer Belag in Höhe des Flüssigkeitsspiegels zeigt nach ein- bis dreiwöchiger Bebrütung Nocardienwachstum an. Vom Wachstumsgürtel wird mit der Impfnadel durch Abschaben eine Subkultur auf den oben beschriebenen Medien angelegt.
Sputum sollte vorher 1:1 mit gepufferter Kochsalzlösung verdünnt werden und anschließend in das flüssige, kohlenhydratfreie Basalmedium eingebracht werden.
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Ein Routinelabor muss in der Lage sein mittels Gram- und modifizierter ZN-Färbung den mikroskopischen Nachweis zu führen und den kulturellen Nachweis aus BAL, Biopsie und Punktat anzustreben (Legionellenplatte). |
IV.4. Pneumocystis carinii
Pneumocystis carinii ist ein ubiquitär vorkommender Erreger von interstitiellen Pneumonien, der weltweit in der Lunge einer Vielzahl von gesunden Wirten (v.a. Nager) auftritt, sich aber nur bei Immunschwäche als sogenannter opportunistischer Parasit explosionsartig
vermehrt.
Wurde der Erreger der Pneumozystose bisher eher zu den Protozoen gerechnet (Struktur der Mitochondrien, Kerne, Golgi Apparat und Teilungsvorgänge), weisen die Untersuchungen der RNA-Sequenzen auf eine Verwandtschaft zu Pilzen hin. Die systematische Stellung
ist derzeit noch unklar.
Übertragung: aerogen (kontaminierter Staubpartikel und Tröpfcheninfektion)
Inkubationszeit: nicht genau bekannt. Die Literaturangaben reichen von einer Woche bis zu 4-8 Wochen in Abhängigkeit von der
aufgenommenen Erregermenge.
Symptome: Fieber, Dyspnoe, Tachypnoe, Tachycardie, Zyanose, unproduktiver Husten und gelegentlich retrosternale Schmerzen.
Es werden sowohl schleichende, mit lange bestehenden uncharakteristischen Symptomen als auch akut fulminante Verlaufsform beschrieben.
Meistens ist der Auskultationsbefund unauffällig.
Befunde: Leukozyten können normal bis erhöht sein, mögliche Eosinophilie. Es besteht typischerweise eine Diskrepanz zwischen Schwere des klinischen Bildes und der verzögerten Ausprägung des röntgenologischen Befundes (doppelseitige, perihilär besonders ausgeprägte
diffuse Infiltrate).
IV.4.1.Untersuchungsmaterial
Das Untersuchungsgut muß Alveolarmaterial enthalten.
• Am besten geeignet ist: BAL-Flüssigkeit (mindestens 10 ml)
• (bedingt) geeignet: induziertes Sputum (HIV-Patienten)
Tracheal- und Bronchialsekret von Kleinkindern
• nicht geeignet: Sputum
IV.4.2. Mikroskopie
Vorbereitung: zentrifugieren (1600 x g für 5 min.) und das Sediment auf mehrere Objektträger auftragen, lufttrocknen und mit Methanol fixieren.
Zähflüssige Materialien sollten vorher 1:1 mit einer 0,1 %igen Dithiothreitol-Lösung versetzt und 15 min. bei Zimmertemperatur verflüssigt werden.
• Giemsa-Färbung: Darstellung von Trophozoiten und intrazystischen Körperchen. Plasma wird blau gefärbt, Kerne rot. Die Zystenwand bleibt ungefärbt. Positive und negative Kontrollpräparate sollten mitgeführt werden.
• Grocott-Gomori-Methenamin-Silberfärbung: Darstellung von Zysten. Die Zysten erscheinen braun-schwarz gefärbt und weisen typische Wandverdickungen auf (ähnlich dem Spalt einer Kaffeebohne).
Positive und negative Kontrollpräparate sollten mitgeführt werden.
• Toluidinblaufärbung: diese Färbung ist jedoch wenig prägnant und schwer zu deuten. Darstellung von Zysten.
• Calcofluor white Färbung: Darstellung von Zysten
• Direkte Immunfluoreszenz: stellt Zysten eindeutig dar (besonders bei geringer Erregermenge von Vorteil).
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die Routinediagnostik festgelegt: Ein klinisch-mikrobiologisches Routinelabor muss in der Lage sein Pneumocystis carinii mittels einer Färbung nachzuweisen. |
IV.5. Zystische Fibrose
MIQ (Mikrobiologisch-lnfektiologische Qualitätsstandards):
Homogenisieren und Verdünnen der Probe (1:100 und 1:10.000)
Kulturmedien:
a) 3 Platten mit bluthaltigem Agarmedium
b) 1 Kochblutagarplatte
c) 1 Lactose-lndikator-Agarglatte
d) 2-3 Pilzplatten (verschiedene Temperaturen und Inkubationszeiten)
e) 1 Selektivplatte für Staph. aureus
f) 1 Ticarcillin-Platte
a)- f) routinemäßig
g) weitere Medien bei spezieller Indikation
h) Flüssigmedium ?
Bebrütung: insgesamt 48 Stunden
| Im Rahmen der Standardisierungssitzung wurden folgende Mindestanforderungen für die mikrobiologische Diagnostik festgelegt: • Kulturmedien: Standardplattensatz wie bei Sputum • Bebrütungsdauer: verlängerte Bebrütung: mindestens 48 Stunden (³ 48 Stunden) • Gezielte Suche nach Burkholderia Spezies |
1. Allerberger F., Prior GH., Niederwieser D., Dierich M.P. (1992): Galcofluor-White-Färbung zum Nachweis von Pneumocystis carinii. Pneumologie 46 (1992) 158-159 Stuttgart New York (Thieme)
2. Ash L., Orihel T. (1997) Atlas of Human Parasitology 4 th ed (ASM)
3. Balows A. et al (1991) Manual of Glinical Microbiology Washington DG (ASM)
4. Baron E.J., Peterson L.R., Finegold S.M. (1994) Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology 9 th ed (Mosby)
5. Bartlett J.G. et al (1987) Laboratory Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections. 7 A: Gumitech, Washington DG (ASM)
6. Bartlet t J.G. et al (1998) Guidelines from the Infectious Deseases Society of America: Gommunity-Acquired Pneumonia in Adults: Guidelines for Management. Glinicallnfectious Diseases 1998; 26:811 -813
7. Brandis H., Köhler W., Eggers HJ., Pulverer G. (1994) Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie 7. Auflage. Stuttgart Jena New York (Gustav Fischer)
8. Burkhardt F. (1992) Mikrobiologische Diagnostik. Stuttgart New York (Thieme)
9. Burkhardt F. (1991) Verfahrensrichtlinien für die Mikrobiologische Diagnostik (DGHM) Infektionen der tiefen Atemwege
10. Dalhoff K., Braun J., Maass H., Wießmann KJ. (1996): Invasive Pneumoniediagnostik bei ambulant erworbenen Pneumonien. Pneumologie 0: 687- 692. Stuttgart New York (Thieme)
11. Garcia LS., Bruckner DA. (1993) Diagnostic Medical Parasitology. 2 nd ed Washington DG (ASM)
12. Isenberg HD. (1998) ) Essential Procedures for Clinical Microbiology (EPCM) American Society for Microbiology. Washington DC (ASM)
13. Krauss H., Weber A., Enders B., Schiefer HG., Zahner H. (1997) Zoonosen: Von Tier zu Mensch Übertragbare Infektionskrankheiten (Deutscher Ärzteverlag)
14. Melhorn H., Piekarski G. (1995) Grundriss der Parasitenkunde Stuttgart Jena New York (Gustav Fischer)
15. MIQ (1999): Infektionen der tiefen Atemwege. Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik 7. DGHM (Urban Fischer)
16. Q-Probes: College of American Pathologists Quality Assurances Services (1991) Q-Probes Programm. Northfield, IL 60093-0800
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