RICHTLINIE "MIKROBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK VON HARNWEGSINFEKTIONEN"
Bundesstaatliche bakteriologisch-serologische Untersuchungsanstalt
4017 Linz, Derfflingerstraße 2
Geschäftsführender Leiter: HR Dr. R. Bauer
Tel: 0732/ 781991; Fax: 0732/ 781991-30
E-Mail: institut@bbsualinz.at
Bundesstaatliche bakteriologisch-serologische Untersuchungsanstalt
4017 Linz, Derfflingerstraße 2
Geschäftsführender Leiter: HR Dr. R. Bauer
Tel: 0732/ 781991; Fax: 0732/ 781991-30
E-Mail: institut@bbsualinz.at
| Die Richtlinie "mikrobiologische Diagnostik von Harnwegsinfektionen" wurde in Anlehnung an die Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), der American Society for Microbiology sowie des britischen Public Health Laboratory Service (PHLS) unter Mitarbeit von Österreichischen Experten im Rahmen des Workshops "Diagnostik von Harnwegsinfektionen" erstellt. Der Workshop fand am 8. Juli 1999 an der Bundesstaatlichen bakteriologisch-serologischen Untersuchungsanstalt unter der Koordination von Dr. Stefan Doppler statt. |
"Harnwegsinfektion" ist ein Sammelbegriff unterschiedlicher klinischer Syndrome, die durch Anwesenheit von Mikroorganismen im normalerweise sterilen Harntrakt und eine mehr oder weniger starke Entzündungsantwort gekennzeichnet sind. Die Einteilung der Harnwegsinfektionen erfolgt üblicherweise nach der anatomischen Lage (Urethritis, Zystitis, Pyelonephritis, [Prostatitis, Epididymitis]) und den zugrunde liegenden Wirtsfaktoren (unkompliziert und kompliziert). Bei Abwesenheit von klinischen Symptomen spricht man von asymptomatischer Bakteriurie.
Aufgabe dieser Richtlinie ist die Beschreibung von Verfahren zur mikrobiologischen Diagnostik von Harnwegsinfektionen durch schnell wachsende Mikroorganismen bei Zystitis und Pyelonephritis.
Aufgabe dieser Richtlinie ist die Beschreibung von Verfahren zur mikrobiologischen Diagnostik von Harnwegsinfektionen durch schnell wachsende Mikroorganismen bei Zystitis und Pyelonephritis.
Am besten geeignet ist der erste Morgenurin, im Idealfall sollten zwischen Gewinnung der Urinprobe und letzter Miktion mindestens drei Stunden liegen. Der Urin sollte möglichst vor Beginn einer antibakteriellen Chemotherapie gewonnen werden. Das Probenvolumen sollte 3 ml nicht unterschreiten.
2.1 Mittelstrahlurin
Diese Gewinnungsform stellt die übliche Urinentnahmeart dar. Auf strikte Reinigungsmaßnahmen sollte Wert gelegt werden (s. Richtlinien der deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (1).
2.2 Einmalkatheterurin
Diese Entnahmetechnik sollte dann angewendet werden, wenn eine einwandfreie Gewinnung von Mittelstrahlurin nicht möglich ist. Nach Einführung des Katheters wird die erste Urinprobe analog der des Mittelstrahlurins verworfen und die mittlere bzw. spätere Probe steril aufgefangen. Auch bei einwandfreier Vorbereitung und Durchführung der Probenentnahme bleibt ein nicht zu vernachlässigendes Kontaminationsrisiko.
2.3 Dauerkatheter
Die Uringewinnung erfolgt durch Punktion des Katheters nach sorgfältiger Desinfektion der bei den meisten handelsüblichen Ableitungssystemen bereits für die Punktion vorgesehenen Einstichstelle. Entnahme aus dem Harnbeutel kann zu Verfälschungen führen.
Die Untersuchung von Katheterspitzen ist abzulehnen. Im Fall eines Katheterwechsels ist die Probe durch den neuen Katheter zu nehmen.
2.4 Suprapubische Blasenpunktion
Durch suprapubische Aspiration von Blasenurin ist eine Kontamination der Probe nahezu ausgeschlossen.
Dieser Eingriff sollte nur nach strenger Indikationsstellung durchgeführt werden.
2.5 Einmalplastikklebebeutel bei Säuglingen
Bei der Harngewinnung mit Einmalklebebeutel bei Säuglingen und Kleinkindern ist eine sorgfältige Reinigung der Genito-Anal-Region erforderlich. Die
bakteriologischen Befunde sollten mit Zurückhaltung interpretiert werden.
2.6 Spezielle Urinentnahmetechniken
- aus Konduit oder Darmersatzblase
- invasive Entnahme aus Ureteren oder Nierenbecken
2.1 Mittelstrahlurin
Diese Gewinnungsform stellt die übliche Urinentnahmeart dar. Auf strikte Reinigungsmaßnahmen sollte Wert gelegt werden (s. Richtlinien der deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (1).
2.2 Einmalkatheterurin
Diese Entnahmetechnik sollte dann angewendet werden, wenn eine einwandfreie Gewinnung von Mittelstrahlurin nicht möglich ist. Nach Einführung des Katheters wird die erste Urinprobe analog der des Mittelstrahlurins verworfen und die mittlere bzw. spätere Probe steril aufgefangen. Auch bei einwandfreier Vorbereitung und Durchführung der Probenentnahme bleibt ein nicht zu vernachlässigendes Kontaminationsrisiko.
2.3 Dauerkatheter
Die Uringewinnung erfolgt durch Punktion des Katheters nach sorgfältiger Desinfektion der bei den meisten handelsüblichen Ableitungssystemen bereits für die Punktion vorgesehenen Einstichstelle. Entnahme aus dem Harnbeutel kann zu Verfälschungen führen.
Die Untersuchung von Katheterspitzen ist abzulehnen. Im Fall eines Katheterwechsels ist die Probe durch den neuen Katheter zu nehmen.
2.4 Suprapubische Blasenpunktion
Durch suprapubische Aspiration von Blasenurin ist eine Kontamination der Probe nahezu ausgeschlossen.
Dieser Eingriff sollte nur nach strenger Indikationsstellung durchgeführt werden.
2.5 Einmalplastikklebebeutel bei Säuglingen
Bei der Harngewinnung mit Einmalklebebeutel bei Säuglingen und Kleinkindern ist eine sorgfältige Reinigung der Genito-Anal-Region erforderlich. Die
bakteriologischen Befunde sollten mit Zurückhaltung interpretiert werden.
2.6 Spezielle Urinentnahmetechniken
- aus Konduit oder Darmersatzblase
- invasive Entnahme aus Ureteren oder Nierenbecken
Der Zeitraum zwischen Harngewinnung und -verarbeitung sollte folgende Dauer nicht überschreiten:
– Nativharn ungekühlt: 4 Stunden (3)
– Nativharn gekühlt (4°C): 48 Stunden
– Harn mit Stabilisatorzusatz: 48 Stunden
– Urineintauchkulturen (Bebrütung max. 24 Stunden): 48 Stunden
3.1 Nativharn
3.1.1 Vorteile
– Makroskopische und mikroskopische Beurteilung möglich (trüb, klar; Leukozyten, Epithelien)
– Gehalt an antibakteriellen Substanzen im Harn kann festgestellt werden
– Bei mikroskopischem Nachweis von Bakterien in ausreichender Zahl kann unter Umständen eine Resistenzbestimmung direkt aus dem Harn durchgeführt werden (s. auch Abs. 4.4.2)
3.1.2 Nachteile
– Bei längerem Transportweg und längerer Aufbewahrung der Probe in ungekühltem Zustand gibt die Keimzahlbestimmung ein falsches Bild über den ursprünglichen Keimgehalt des Harnes
– Im Allgemeinen größerer Arbeitsaufwand, der jedoch durch rationelle Verarbeitungstechnik zum Teil ausgeglichen werden kann
3.2 Eintauchkultur
3.2.1 Vorteile
– Keimzahl zum Zeitpunkt der Harngewinnung kann festgehalten werden
– Einfache Screening-Methode
– Relativ problemlos bei Verzögerungen von Transport und Verarbeitung
3.2.2 Nachteile
– Keine Aussage über makroskopische und mikroskopische Beschaffenheit der Probe
– Das Vorhandensein von antibakteriellen Substanzen kann
a) nicht entdeckt werden
b) das Anwachsen von Kolonien verhindern (falsch negativer Befund)
– Keimzahlbestimmung bei Vorliegen konfluierender Kolonien nicht zuverlässig
Beim Postversand von ungekühltem Nativharn wird die Verwendung von Stabilisatoren gefordert.
– Nativharn ungekühlt: 4 Stunden (3)
– Nativharn gekühlt (4°C): 48 Stunden
– Harn mit Stabilisatorzusatz: 48 Stunden
– Urineintauchkulturen (Bebrütung max. 24 Stunden): 48 Stunden
3.1 Nativharn
3.1.1 Vorteile
– Makroskopische und mikroskopische Beurteilung möglich (trüb, klar; Leukozyten, Epithelien)
– Gehalt an antibakteriellen Substanzen im Harn kann festgestellt werden
– Bei mikroskopischem Nachweis von Bakterien in ausreichender Zahl kann unter Umständen eine Resistenzbestimmung direkt aus dem Harn durchgeführt werden (s. auch Abs. 4.4.2)
3.1.2 Nachteile
– Bei längerem Transportweg und längerer Aufbewahrung der Probe in ungekühltem Zustand gibt die Keimzahlbestimmung ein falsches Bild über den ursprünglichen Keimgehalt des Harnes
– Im Allgemeinen größerer Arbeitsaufwand, der jedoch durch rationelle Verarbeitungstechnik zum Teil ausgeglichen werden kann
3.2 Eintauchkultur
3.2.1 Vorteile
– Keimzahl zum Zeitpunkt der Harngewinnung kann festgehalten werden
– Einfache Screening-Methode
– Relativ problemlos bei Verzögerungen von Transport und Verarbeitung
3.2.2 Nachteile
– Keine Aussage über makroskopische und mikroskopische Beschaffenheit der Probe
– Das Vorhandensein von antibakteriellen Substanzen kann
a) nicht entdeckt werden
b) das Anwachsen von Kolonien verhindern (falsch negativer Befund)
– Keimzahlbestimmung bei Vorliegen konfluierender Kolonien nicht zuverlässig
Beim Postversand von ungekühltem Nativharn wird die Verwendung von Stabilisatoren gefordert.
Verschiedenste Screening-Methoden wurden für den Nachweis von Bakteriurie und Pyurie entwickelt und viele können in manchen Laboratorien nützlich sein. Gegenwärtig gibt es jedoch kein einzelnes genaues, schnelles und kosteneffizientes System, das für den Routineeinsatz in allen Untersuchungslaboratorien empfohlen werden könnte.
Der Untersuchungsgang bei Nativharnen umfasst folgende Schritte:
– Abschätzung der Entzündungsreaktion
– Hemmstofftest
– Quantitativ-kulturelle Untersuchung
– Erregerdifferenzierung
– Resistenztestung
4.1 Abschätzung der Entzündungsreaktion
Eine Bestimmung der Leukozyten sollte bei trüben Harnen quantitativerfolgen, da sie wertvolle Hinweise zur Interpretation der kulturellen Ergebnisse gibt.
Zur Abschätzung der Entzündungsreaktion stehen die folgenden Methoden zur Verfügung:
4.1.1 Teststreifen (Leukozytenesterase, Nitrit)
Bei Materialien mit langen Transportzeiten haben diese Teststreifen den Vorteil, dass durch die Messung der Esterase-Aktivität auch diejenigen Leukozyten mit erfasst werden, die beim Zählkammerverfahren - bedingt durch die lange Transportzeit des Materials - nicht mehr als korpuskuläre Elemente bestimmt werden können.
4.1.2 Mikroskopische Methoden
4.1.2.1 Gramfärbung des unzentrifugierten Harns
Obwohl die Gramfärbung des unzentrifugierten Harns Limitationen unterliegt (z. B. fehlende Sensitivität bei weniger als 10 5 KBE/ml), sollte sie für die Anwendung in ausgewählten Fällen zur Verfügung stehen (2).
Der Urin wird gründlich durchmischt; ein Tropfen des unzentrifugierten Materials wird auf einen Objektträger gegeben, aber nicht verteilt. Der Tropfen wird luftgetrocknet, fixiert und nach Gram gefärbt.
Bei der Beurteilung (Ölimmersionsobjektiv, Vergrößerung ca. 1000fach) wird auf Bakterien (ein Bakterium pro Gesichtsfeld entspricht etwa einer Keimzahl von 10 5/ml) und zelluläre Elemente (Leukozyten, Erythrozyten, Uroepithelien und typische Vaginalepithelien) geachtet. Dabei weist das Auftreten von Leukozyten auf eine Entzündung hin, während der Nachweis von
Vaginalepithelzellen und Mischflora eine Kontamination der Probe anzeigt, die eine Wiederholungsuntersuchung angeraten macht.
4.1.2.2 Mikroskopische Untersuchung des Harnsediments
Etwa 5 ml werden 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, nach Abgießen des Überstands mit restlicher Flüssigkeit gemischt und auf einen Objektträger ausgestrichen. Die Begutachtung erfolgt im Grampräparat oder nativ.
Die Eignung zur mikrobiologischen Befundinterpretation ist kritisch zu hinterfragen.
4.1.2.3 Phasenkontrast-mikroskopische Untersuchung des Nativharns
Ein Tropfen unzentrifugierten Harns wird auf einem Objektträger mikroskopiert.
4.1.2.4 Zählkammermethode
Leukozyten und Erythrozyten werden in frisch gewonnenem, nativem, unzentrifugiertem Urin in einer Zählkammer bestimmt. Hierfür ist die Phasenkontrastmikroskopie sehr gut geeignet. Eine Zellzahl von bis zu 10 Leukozyten/µl Urin wird als normal angesehen.
Bei der Untersuchung sollte auch auf verschiedene Zylinder, z. B. Leukozytenzylinder, geachtet werden.
4.1.3 Automatisierte Methoden
z. B. Partikelzählung, Impedanzmessung, Photometrie, Bioluminiszenz, colorimetrische Filtration.
Eine Kosten-Nutzen-Analyse ist aufgrund mangelnder Erfahrung mit diesen Systemen derzeit noch nicht möglich.
4.2. Kulturelle Untersuchung
Die kulturelle Untersuchung muss quantitativ durchgeführt werden.
4.2.1 Nährmedien/Plattensatz
Bei Hinweis auf erhöhte Keimzahlen (trüber Harn, Grampräparat) sollten grundsätzlich mindestens zwei Nährmedien verwendet werden. Es empfiehlt sich neben einem Universalmedium (z. B. Blutagar), das das Wachstum sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Mikroorganismen zulässt, ein selektives Nährmedium für Enterobakterien zu beimpfen. Hierbei kommen neben einem Medium mit Laktose-Indikator (z. B. MacConkey) auch ein Medium mit niedrigem Elektrolytgehalt (z. B. CLED) zur Hemmung des Schwärmphänomens bei Proteus sp. in Frage. Eine zusätzliche Beimpfung von Indikator- und/oder Selektivnährmedien, eventuell nach Maßgabe des Grampräparats, erleichtert die vorläufige Erregerdifferenzierung. Ob sich bei Verwendung von chromogenen Harnplatten das Mitführen eines zweiten Agarmediums erübrigt, kann aufgrund des Fehlens fundierter Studienergebnisse derzeit noch nicht entschieden werden.
Die Inkubationsdauer beträgt 16-24 Stunden; bei gezielter Fragestellung nach Pilzinfektion ist sie auf 48 Stunden auszudehnen.
Bei klaren Harnen ohne Hinweis auf erhöhte Keimzahl genügt eventuell die Kultur auf einem Universalmedium. Es kann eine Flüssigkultur (z. B. Brain-Heart, Thioglycolat, Casein-Sojapepton) beimpft werden, welche bei Diskrepanz zwischen kulturellem und mikroskopischem
Befund, insbesondere bei positivem Hemmstofftest, ausgesät wird. Bei Blasenpunktionsharn wird das Mitführen einer Flüssigkultur empfohlen.
4.2.2 Verfahren zur Keimzahlbestimmung
4.2.2.1 Keimzahlbestimmung mit kalibrierter Öse
Hierzu werden Ösen verwendet, die ein bestimmtes Volumen (1 µl oder 10 µl) fassen. Diese sind kommerziell erhältlich oder können nach einschlägigen Verfahren selbst kalibriert werden.
In den gut aufgeschüttelten Urin wird die kalibrierte Öse senkrecht knapp unter die Oberfläche eingeführt und genauso wieder entnommen.
Mit der Öse wird über eine oder eine halbierte Agarplatte gestrichen und danach das Material mit der Öse netzförmig auf der Agaroberfläche verteilt.
Bebrütung 16-24 h bei 36 ± 1 °C.
Bestimmung der Keimzahl getrennt nach Spezies.
Die Verwendung von 10 µl-Ösen ist sensitiver (Detektionsgrenze 102 Keime pro ml). Es ist jedoch bei höheren Keimzahlen vermehrt mit konfluierendem Kolonienwachstum zu rechnen.
Deshalb sollte zusätzlich eine 1:100-Verdünnung (Herstellung z. B. mittels 10-µl-Öse und 1 ml physiologischer Kochsalzlösung) in analoger Weise ausgestrichen werden.
4.2.2.2 Keimzahlbestimmung mittels Mikroliterpipetten
Bei der Verwendung von Mikroliterpipetten ist zu bedenken, dass diese zwar genauer als kalibrierte Ösen sind, jedoch große Probleme hinsichtlich Kontamination und Dekontamination aufweisen.
4.2.2.3 Flooding- oder Spatelverfahren
Vom gut durchmischten Urin eine 1:100-Verdünnung in physiologischer Kochsalzlösung herstellen.
0, 1 ml dieser Verdünnung mit einer Pipette in die Mitte der Nährmedien pipettieren und Material mit einem Glasspatel verteilen.
16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrüten.
Keimzahl getrennt nach Spezies bestimmen.
Alternative:
Urinverdünnungen von 1:100 und 1:10000 werden in einer Menge von je 1 ml mittels Spatel gleichmäßig auf der Oberfläche der Nährmedien verteilt.
4.2.2.4 Plattengussverfahren (arbeitsintensiver Goldstandard)
Urin gut durchmischen und eine 1 :100-Verdünnung in steriler physiologischer Kochsalzlösung herstellen.
0,1 ml Verdünnung in eine leere, sterile Petrischale pipettieren und etwa 15 ml verflüssigten, auf etwa 46 °C abgekühlten Nähragar zufügen und durch Schwenken der Platte gründlich mit der Urinverdünnung mischen. Substrat erstarren lassen.
16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrüten.
Koloniezahl der Gussplatte bestimmen und durch Multiplikation die Ausgangskeimzahl ermitteln.
Gleichzeitig sollte ein Ausstrich auf geeigneten Nährmedien (z. B. Blutagar und MacConkey) erfolgen.
Wenn niedrigere Keimzahlen erwartet und als signifikant erachtet werden, sollen generell größere Inokula (z. B. 0,1 ml) verwendet werden.
4.3 Prüfung auf antibakterielle Hemmstoffe
Der Hemmstofftest wird mit Agarplatten, die Sporen von Bacillus subtilis ATCC 6633 enthalten, durchgeführt. Für bestimmte Antibiotika (z. B. Fosfomycin, Aztreonam) ist dieses Nachweisverfahren nicht geeignet.
Auf den Agar werden bis zu 8 Antibiotika-freie Filterplättchen (alternative in Filterpapier-Stern) gelegt, die mit ca. 10 µl des nativen Urins beschickt werden. Die Platten werden für 16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrütet und auf Hemmhöfe um die Filterplättchen untersucht. Jede Hemmung des Wachstums von Bacillus subtilis wird als Nachweis von Hemmstoffaktivität gewertet. Auch käuflich erhältliche Sporenstreifen sind geeignet. Beim Nachweis von Hemmstoffen im Urin sind die normalerweise angewendeten Grenzwerte für eine signifikante Bakteriurie nicht mehr gültig. Hier ist bei
Vorliegen von Reinkulturen immer, bei Mischkulturen in Abhängigkeit von deren Zusammensetzung und dem Vorbefund eine Differenzierung und Resistenzbestimmung durchzuführen.
4.4 Weiterverarbeitung
Inwieweit eine Spezies- und Resistenzbestimmung der nachgewiesenen Mikroorganismen notwendig ist, hängt von der Keimzahl und der klinischen Situation ab.
4.4.1 Identifizierung
Im ambulanten Bereich ist es durchaus vertretbar, bei einer unkomplizierten Zystitis oder Pyelonephritis die Identifizierung der Mikroorganismen nicht immer bis zur Spezies-Ebene durchzuführen. Eine Differenzierung in Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella/Enterobacter bei den Enterobacteriaceen sowie Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
agalactiae und Enterokokken bei den grampositiven Bakterien dürfte hier in der Regel ausreichend sein.
Demgegenüber ist bei sämtlichen komplizierten und bei allen im Krankenhaus erworbenen Infektionen eine möglichst genaue Speziesbestimmung durchzuführen.
Für Mikroorganismen, die aufgrund ihrer niedrigen Keimzahl oder wegen ihres normalerweise physiologischen Vorkommens als Kontaminanten eingestuft werden, ist eine deskriptive Identifizierung über Koloniemorphologie und Gramfärbung (z. B. vergrünende Streptokokken, koryneforme Bakterien, koagulase-negative Staphylokokken) ausreichend. Das gilt auch für ungewöhnliche Mischkulturen, deren
Nachweis auf vermutlich unsachgemäße Abnahmetechnik hinweist.
4.4.2 Resistenzbestimmung
Die Resistenzbestimmung der aus dem Urin angezüchteten, schnell wachsenden Mikroorganismen erfolgt nach einschlägigen Verfahrensrichtlinien (NCCLS (4)). Davon abweichend kann bei klinisch-chemischem bzw. mikroskopischem Anhalt für eine Harnwegsinfektion auch eine Resistenzbestimmung direkt aus dem Urin durchgeführt werden. Alternativ kann auch eine direkte Empfindlichkeitstestung nach Bebrütung über einige Stunden aus einem Flüssignährmedium versucht werden.
Die Resistenzbestimmung muss jedoch mit dem Standardverfahren wiederholt werden, wenn folgende Voraussetzungen vorliegen:
- keine Reinkultur
- Keimzahl < 10 5
- unübliches Resistenzmuster
Der Untersuchungsgang bei Nativharnen umfasst folgende Schritte:
– Abschätzung der Entzündungsreaktion
– Hemmstofftest
– Quantitativ-kulturelle Untersuchung
– Erregerdifferenzierung
– Resistenztestung
4.1 Abschätzung der Entzündungsreaktion
Eine Bestimmung der Leukozyten sollte bei trüben Harnen quantitativerfolgen, da sie wertvolle Hinweise zur Interpretation der kulturellen Ergebnisse gibt.
Zur Abschätzung der Entzündungsreaktion stehen die folgenden Methoden zur Verfügung:
4.1.1 Teststreifen (Leukozytenesterase, Nitrit)
Bei Materialien mit langen Transportzeiten haben diese Teststreifen den Vorteil, dass durch die Messung der Esterase-Aktivität auch diejenigen Leukozyten mit erfasst werden, die beim Zählkammerverfahren - bedingt durch die lange Transportzeit des Materials - nicht mehr als korpuskuläre Elemente bestimmt werden können.
4.1.2 Mikroskopische Methoden
4.1.2.1 Gramfärbung des unzentrifugierten Harns
Obwohl die Gramfärbung des unzentrifugierten Harns Limitationen unterliegt (z. B. fehlende Sensitivität bei weniger als 10 5 KBE/ml), sollte sie für die Anwendung in ausgewählten Fällen zur Verfügung stehen (2).
Der Urin wird gründlich durchmischt; ein Tropfen des unzentrifugierten Materials wird auf einen Objektträger gegeben, aber nicht verteilt. Der Tropfen wird luftgetrocknet, fixiert und nach Gram gefärbt.
Bei der Beurteilung (Ölimmersionsobjektiv, Vergrößerung ca. 1000fach) wird auf Bakterien (ein Bakterium pro Gesichtsfeld entspricht etwa einer Keimzahl von 10 5/ml) und zelluläre Elemente (Leukozyten, Erythrozyten, Uroepithelien und typische Vaginalepithelien) geachtet. Dabei weist das Auftreten von Leukozyten auf eine Entzündung hin, während der Nachweis von
Vaginalepithelzellen und Mischflora eine Kontamination der Probe anzeigt, die eine Wiederholungsuntersuchung angeraten macht.
4.1.2.2 Mikroskopische Untersuchung des Harnsediments
Etwa 5 ml werden 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, nach Abgießen des Überstands mit restlicher Flüssigkeit gemischt und auf einen Objektträger ausgestrichen. Die Begutachtung erfolgt im Grampräparat oder nativ.
Die Eignung zur mikrobiologischen Befundinterpretation ist kritisch zu hinterfragen.
4.1.2.3 Phasenkontrast-mikroskopische Untersuchung des Nativharns
Ein Tropfen unzentrifugierten Harns wird auf einem Objektträger mikroskopiert.
4.1.2.4 Zählkammermethode
Leukozyten und Erythrozyten werden in frisch gewonnenem, nativem, unzentrifugiertem Urin in einer Zählkammer bestimmt. Hierfür ist die Phasenkontrastmikroskopie sehr gut geeignet. Eine Zellzahl von bis zu 10 Leukozyten/µl Urin wird als normal angesehen.
Bei der Untersuchung sollte auch auf verschiedene Zylinder, z. B. Leukozytenzylinder, geachtet werden.
4.1.3 Automatisierte Methoden
z. B. Partikelzählung, Impedanzmessung, Photometrie, Bioluminiszenz, colorimetrische Filtration.
Eine Kosten-Nutzen-Analyse ist aufgrund mangelnder Erfahrung mit diesen Systemen derzeit noch nicht möglich.
4.2. Kulturelle Untersuchung
Die kulturelle Untersuchung muss quantitativ durchgeführt werden.
4.2.1 Nährmedien/Plattensatz
Bei Hinweis auf erhöhte Keimzahlen (trüber Harn, Grampräparat) sollten grundsätzlich mindestens zwei Nährmedien verwendet werden. Es empfiehlt sich neben einem Universalmedium (z. B. Blutagar), das das Wachstum sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Mikroorganismen zulässt, ein selektives Nährmedium für Enterobakterien zu beimpfen. Hierbei kommen neben einem Medium mit Laktose-Indikator (z. B. MacConkey) auch ein Medium mit niedrigem Elektrolytgehalt (z. B. CLED) zur Hemmung des Schwärmphänomens bei Proteus sp. in Frage. Eine zusätzliche Beimpfung von Indikator- und/oder Selektivnährmedien, eventuell nach Maßgabe des Grampräparats, erleichtert die vorläufige Erregerdifferenzierung. Ob sich bei Verwendung von chromogenen Harnplatten das Mitführen eines zweiten Agarmediums erübrigt, kann aufgrund des Fehlens fundierter Studienergebnisse derzeit noch nicht entschieden werden.
Die Inkubationsdauer beträgt 16-24 Stunden; bei gezielter Fragestellung nach Pilzinfektion ist sie auf 48 Stunden auszudehnen.
Bei klaren Harnen ohne Hinweis auf erhöhte Keimzahl genügt eventuell die Kultur auf einem Universalmedium. Es kann eine Flüssigkultur (z. B. Brain-Heart, Thioglycolat, Casein-Sojapepton) beimpft werden, welche bei Diskrepanz zwischen kulturellem und mikroskopischem
Befund, insbesondere bei positivem Hemmstofftest, ausgesät wird. Bei Blasenpunktionsharn wird das Mitführen einer Flüssigkultur empfohlen.
4.2.2 Verfahren zur Keimzahlbestimmung
4.2.2.1 Keimzahlbestimmung mit kalibrierter Öse
Hierzu werden Ösen verwendet, die ein bestimmtes Volumen (1 µl oder 10 µl) fassen. Diese sind kommerziell erhältlich oder können nach einschlägigen Verfahren selbst kalibriert werden.
In den gut aufgeschüttelten Urin wird die kalibrierte Öse senkrecht knapp unter die Oberfläche eingeführt und genauso wieder entnommen.
Mit der Öse wird über eine oder eine halbierte Agarplatte gestrichen und danach das Material mit der Öse netzförmig auf der Agaroberfläche verteilt.
Bebrütung 16-24 h bei 36 ± 1 °C.
Bestimmung der Keimzahl getrennt nach Spezies.
Die Verwendung von 10 µl-Ösen ist sensitiver (Detektionsgrenze 102 Keime pro ml). Es ist jedoch bei höheren Keimzahlen vermehrt mit konfluierendem Kolonienwachstum zu rechnen.
Deshalb sollte zusätzlich eine 1:100-Verdünnung (Herstellung z. B. mittels 10-µl-Öse und 1 ml physiologischer Kochsalzlösung) in analoger Weise ausgestrichen werden.
4.2.2.2 Keimzahlbestimmung mittels Mikroliterpipetten
Bei der Verwendung von Mikroliterpipetten ist zu bedenken, dass diese zwar genauer als kalibrierte Ösen sind, jedoch große Probleme hinsichtlich Kontamination und Dekontamination aufweisen.
4.2.2.3 Flooding- oder Spatelverfahren
Vom gut durchmischten Urin eine 1:100-Verdünnung in physiologischer Kochsalzlösung herstellen.
0, 1 ml dieser Verdünnung mit einer Pipette in die Mitte der Nährmedien pipettieren und Material mit einem Glasspatel verteilen.
16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrüten.
Keimzahl getrennt nach Spezies bestimmen.
Alternative:
Urinverdünnungen von 1:100 und 1:10000 werden in einer Menge von je 1 ml mittels Spatel gleichmäßig auf der Oberfläche der Nährmedien verteilt.
4.2.2.4 Plattengussverfahren (arbeitsintensiver Goldstandard)
Urin gut durchmischen und eine 1 :100-Verdünnung in steriler physiologischer Kochsalzlösung herstellen.
0,1 ml Verdünnung in eine leere, sterile Petrischale pipettieren und etwa 15 ml verflüssigten, auf etwa 46 °C abgekühlten Nähragar zufügen und durch Schwenken der Platte gründlich mit der Urinverdünnung mischen. Substrat erstarren lassen.
16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrüten.
Koloniezahl der Gussplatte bestimmen und durch Multiplikation die Ausgangskeimzahl ermitteln.
Gleichzeitig sollte ein Ausstrich auf geeigneten Nährmedien (z. B. Blutagar und MacConkey) erfolgen.
Wenn niedrigere Keimzahlen erwartet und als signifikant erachtet werden, sollen generell größere Inokula (z. B. 0,1 ml) verwendet werden.
4.3 Prüfung auf antibakterielle Hemmstoffe
Der Hemmstofftest wird mit Agarplatten, die Sporen von Bacillus subtilis ATCC 6633 enthalten, durchgeführt. Für bestimmte Antibiotika (z. B. Fosfomycin, Aztreonam) ist dieses Nachweisverfahren nicht geeignet.
Auf den Agar werden bis zu 8 Antibiotika-freie Filterplättchen (alternative in Filterpapier-Stern) gelegt, die mit ca. 10 µl des nativen Urins beschickt werden. Die Platten werden für 16-24 h bei 36 ± 1 °C bebrütet und auf Hemmhöfe um die Filterplättchen untersucht. Jede Hemmung des Wachstums von Bacillus subtilis wird als Nachweis von Hemmstoffaktivität gewertet. Auch käuflich erhältliche Sporenstreifen sind geeignet. Beim Nachweis von Hemmstoffen im Urin sind die normalerweise angewendeten Grenzwerte für eine signifikante Bakteriurie nicht mehr gültig. Hier ist bei
Vorliegen von Reinkulturen immer, bei Mischkulturen in Abhängigkeit von deren Zusammensetzung und dem Vorbefund eine Differenzierung und Resistenzbestimmung durchzuführen.
4.4 Weiterverarbeitung
Inwieweit eine Spezies- und Resistenzbestimmung der nachgewiesenen Mikroorganismen notwendig ist, hängt von der Keimzahl und der klinischen Situation ab.
4.4.1 Identifizierung
Im ambulanten Bereich ist es durchaus vertretbar, bei einer unkomplizierten Zystitis oder Pyelonephritis die Identifizierung der Mikroorganismen nicht immer bis zur Spezies-Ebene durchzuführen. Eine Differenzierung in Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella/Enterobacter bei den Enterobacteriaceen sowie Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
agalactiae und Enterokokken bei den grampositiven Bakterien dürfte hier in der Regel ausreichend sein.
Demgegenüber ist bei sämtlichen komplizierten und bei allen im Krankenhaus erworbenen Infektionen eine möglichst genaue Speziesbestimmung durchzuführen.
Für Mikroorganismen, die aufgrund ihrer niedrigen Keimzahl oder wegen ihres normalerweise physiologischen Vorkommens als Kontaminanten eingestuft werden, ist eine deskriptive Identifizierung über Koloniemorphologie und Gramfärbung (z. B. vergrünende Streptokokken, koryneforme Bakterien, koagulase-negative Staphylokokken) ausreichend. Das gilt auch für ungewöhnliche Mischkulturen, deren
Nachweis auf vermutlich unsachgemäße Abnahmetechnik hinweist.
4.4.2 Resistenzbestimmung
Die Resistenzbestimmung der aus dem Urin angezüchteten, schnell wachsenden Mikroorganismen erfolgt nach einschlägigen Verfahrensrichtlinien (NCCLS (4)). Davon abweichend kann bei klinisch-chemischem bzw. mikroskopischem Anhalt für eine Harnwegsinfektion auch eine Resistenzbestimmung direkt aus dem Urin durchgeführt werden. Alternativ kann auch eine direkte Empfindlichkeitstestung nach Bebrütung über einige Stunden aus einem Flüssignährmedium versucht werden.
Die Resistenzbestimmung muss jedoch mit dem Standardverfahren wiederholt werden, wenn folgende Voraussetzungen vorliegen:
- keine Reinkultur
- Keimzahl < 10 5
- unübliches Resistenzmuster
5.1 Mittelstrahlurin
Liegt die Keimzahl unter 10³/ml, kann bei negativem Hemmstoffnachweis in der Regel davon ausgegangen werden, dass keine Harnwegsinfektion vorliegt.Bei Keimzahlen zwischen 10³ und 104/ml ist eine Harnwegsinfektion bei Erwachsenen kaum anzunehmen, im Einzelfall aber nicht auszuschließen; ab 104/ml wird sie wahrscheinlicher.
Bei Kindern ist die Signifikanzgrenze geringer: Keimzahlen um 104/ml gelten hier vielfach schon als Ausdruck einer bestehenden Harnwegsinfektion. Trotz der inhärenten Probleme von artifiziellen Grenzwerten ist eine Befundinterpretation grundsätzlich zu begrüßen.
Als Beispiel wird Tabelle 1 angeführt (1).
KZ: Keimzahl, D: Differenzierung, Id: vollständige Differenzierung, B: deskriptive Differenzierung, AB: Antibiogramm, HWI: Harnwegsinfektion
5.2 Katheterurin
Die Signifikanzgrenze wird um den Faktor 10 tiefer angesetzt, ansonsten gelten ähnliche Beurteilungskriterien wie beim Mittelstrahlurin.
5.3 Punktionsurin
Sämtliche angezüchteten Mikroorganismen sind unabhängig von ihrer Konzentration als Erreger zu werten und zu differenzieren (Spezies-Ebene), wenn die Übrigen Kriterien der Entzündung gegeben sind. Beim Nachweis von Bakterien der physiologischen Hautflora ist eine Kontamination nicht auszuschließen.
Liegt die Keimzahl unter 10³/ml, kann bei negativem Hemmstoffnachweis in der Regel davon ausgegangen werden, dass keine Harnwegsinfektion vorliegt.Bei Keimzahlen zwischen 10³ und 104/ml ist eine Harnwegsinfektion bei Erwachsenen kaum anzunehmen, im Einzelfall aber nicht auszuschließen; ab 104/ml wird sie wahrscheinlicher.
Bei Kindern ist die Signifikanzgrenze geringer: Keimzahlen um 104/ml gelten hier vielfach schon als Ausdruck einer bestehenden Harnwegsinfektion. Trotz der inhärenten Probleme von artifiziellen Grenzwerten ist eine Befundinterpretation grundsätzlich zu begrüßen.
Als Beispiel wird Tabelle 1 angeführt (1).
KZ | Anzahl | Angaben zur Klinik | Bewertung | D | AB |
| ³ 105 | 1 Keim pathogen | HWI wahrscheinlich | Id | + | |
| 1 Keim Kontaminante | Kontamination wahrscheinlich, HWI zweifelhaft, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| 2 Keime, vorherrschende Spezies pathogen | HWI durch vorherrschende Spezies wahrscheinlich, Kontamination möglich, Kontrolle empfohlen | Id | + | ||
| 2 Keime, vorherrschende Spezies Kontaminante | Kontamination wahrscheinlich, HWI möglich, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| 2 Keime, beide ³ 105, beide pathogen | rezidivierende oder chronische Infektion | HWI wahrscheinlich | Id | + | |
| 2 Keime, beide ³ 105, 1 pathogen 1 Kontaminante | HWI durch pathogene Spezies wahrscheinlich | Id | + | ||
| 2 Keime, beide ³ 105, 2 Kontaminanten | Bakterien der physiologischen Flora, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| 3 Keime oder mehr, keine Spezies ³ 105 | Mikroorganismen verschiedener Spezies nachgewiesen, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| 3 Keime oder mehr, 1 Spezies ³ 105 | Kontamination wahrscheinlich, HWI möglich, Kontrolle empfohlen | Id | + | ||
| 3 Keime oder mehr, > 1 Spezies ³ 105 | Mikroorganismen verschiedener Spezies nachgewiesen, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| < 105 | |||||
| 1 Keim, pathogen | weibl. Pat. mit Urethritis, sympt. männl. Pat., Kinder, Transplantierte, chron/rez. HWI, positiver Hemmstofftest | HWI möglich, Kontamination nicht ausgeschlossen, Kontrolle empfohlen | Id | + | |
| 1 Keim, pathogen mit 104 | keine Angaben zur Klinik | HWI zweifelhaft, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – | |
| 1 Keim, Kontaminante mit 104 | HWI zweifelhaft, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – | ||
| 2 oder mehr Keime | Mikroorganismen verschiedener Spezies nachgewiesen, Kontamination wahrscheinlich, Kontrolle empfohlen | B | – |
5.2 Katheterurin
Die Signifikanzgrenze wird um den Faktor 10 tiefer angesetzt, ansonsten gelten ähnliche Beurteilungskriterien wie beim Mittelstrahlurin.
5.3 Punktionsurin
Sämtliche angezüchteten Mikroorganismen sind unabhängig von ihrer Konzentration als Erreger zu werten und zu differenzieren (Spezies-Ebene), wenn die Übrigen Kriterien der Entzündung gegeben sind. Beim Nachweis von Bakterien der physiologischen Hautflora ist eine Kontamination nicht auszuschließen.
1 MIQ (1997): Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-serologischen Diagnostik.
Im Auftrag der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, hrsg. von H. Mauch, R. Lütticken und S.Gatermann.
2 Harnwegsinfektionen / Gatermann, Podschun, Schmidt, Wittke, Naber, Sietzen, Straube.
Gustav-Fischer-Verlag
3 Clarridge JE, Johnson JR, Pezzlo MT, Weissfeld AS (coordinating ed.) (1998) Cumitech 28;
Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections. American Society for Microbiology, Washington, Washington DC
4 PHLS -Standard Operating Procedure (1998)
Investigation of Urin, Standard Operating Procedure B.SOP 41 issued by Public Health Laboratory Service, Technical Services Division, Colindale
5 NCCLS (1999): Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; M100-S9. NCCLS, Wayne, Pennsylvania, USA
Im Auftrag der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, hrsg. von H. Mauch, R. Lütticken und S.Gatermann.
2 Harnwegsinfektionen / Gatermann, Podschun, Schmidt, Wittke, Naber, Sietzen, Straube.
Gustav-Fischer-Verlag
3 Clarridge JE, Johnson JR, Pezzlo MT, Weissfeld AS (coordinating ed.) (1998) Cumitech 28;
Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections. American Society for Microbiology, Washington, Washington DC
4 PHLS -Standard Operating Procedure (1998)
Investigation of Urin, Standard Operating Procedure B.SOP 41 issued by Public Health Laboratory Service, Technical Services Division, Colindale
5 NCCLS (1999): Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; M100-S9. NCCLS, Wayne, Pennsylvania, USA
