NATIONALE REFERENZZENTRALE FÜR MYKOBAKTERIEN
an der
Bundesstaatlichenbakteriologisch-serologischen Untersuchungsanstalt
1096 Wien, Währinger Straße 25a
Leiter: Univ.-Prof. Dr. G. Wewalka
Tel. 01-405 15 57, Fax 01-402 39 00
E-Mail: bbsuawien@aon.at
an der
Bundesstaatlichenbakteriologisch-serologischen Untersuchungsanstalt
1096 Wien, Währinger Straße 25a
Leiter: Univ.-Prof. Dr. G. Wewalka
Tel. 01-405 15 57, Fax 01-402 39 00
E-Mail: bbsuawien@aon.at
| Die Richtlinie "Diagnostik von Mykobakterien" und "Differenzierter Einsatz von Untersuchungstechniken zum Nachweis von Tuberkulosebakterien" wurde in Anlehnung an die DIN-Norm 58943 und die wissenschaftlichen Erkenntnisse des Arbeitskreises Mykobakterien am 1. Oktober 1998 in Wien (Hygieneinstitut der Universität) unter Leitung von Dr. F. Stauffer, Leiter der Nationalen Referenzzentrale für Mykobakterien an der Bundesstaatlichen bakteriologisch-serologischen Untersuchungsanstalt Wien erarbeitet. |
Die Gattung Mycobacterium gehört in die Ordnung der Actinomycetales und in die Familie der Mycobacteriacae. Nach infektiologischen und epidemiologischen Kriterien lässt sich die Gattung Mycobacterium in drei Gruppen einteilen:
1.1 Tuberkulosebakterien (Mycobacterium tuberculosis complex)
1.2 Atypische Mykobakterien (Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)
1.3 Mycobacterium leprae
1.1 Tuberkulosebakterien (Mycobacterium tuberculosis complex)
1.2 Atypische Mykobakterien (Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)
1.3 Mycobacterium leprae
2.1 Empfehlung der diagnostischen Materialien
2.1.1 Sputum
ist das aus den tieferen Atemwegen spontan oder durch Provokation hervorgebrachte Sekret.
- Menge: soviel wie möglich, nicht mehr als 10 ml, kein Speichel, Morgensputum
- Anzahl: mindestens 3 Sputa, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
- Hinweis: Besonders das erste Sputum nach Gewinnung von Bronchialsekret oder Bronchoalveolärer Lavage erweist sich als besonders ergiebig.
2.1.2 Bronchialsekrete und Trachealsekrete
sind die instrumentell mit oder ohne Spülung gewonnenen Sekrete der tieferen Atemwege.
2.1.3 Magenspülwasser
ist der mittels einer Sonde beim nüchternen Patienten durch Spülung mit sterilem isotonem NaCl (0,9 %) gewonnene Mageninhalt (besonders geeignet bei Kindern und wenn kein Sputum möglich). Proben sofort nach Gewinnung mit konzentriertem Trinatriumphosphatpuffer (1-2 ml auf 50 ml) versetzen.
2.1.4 Morgenurin (Erststrahlharn)
ist der erste nach der Nachtruhe entleerte Urin.
- Menge: 30-100 ml
- Anzahl: mindestens 3 Harne, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
2.1.5 Gewebeproben, Abstriche, Punktate
sollen vor dem Verdunsten geschützt und in sterilen Gefäßen versandt werden. Ist bei Gefahr einer Austrocknung der Zusatz von Aqua destillata erforderlich, so muss dieses steril und im Volumen so gering wie möglich sein und darf keine bakterienhemmenden Zusätze enthalten.
- Hinweis: Bei Hautgewebeproben muss ein Kulturröhrchen bei 30 °C bebrütet werden.
- Menge: nach Rücksprache mit dem Labor
2.1.6 Menstrualblut
zweimalige Einsendung am 1. und 3. Tag der Menstruation, Abstrich oder Tampon, gleich nach Gewinnung in sterilem Aqua destillata auslaugen.
2.1.7 Liquor
- Menge: soviel wie möglich (nach Möglichkeit nicht weniger als 2 ml), Versand in sterilen Gefäßen
2.1.8 Stuhl
- Menge: 1 g (haselnussgroß)
- Anzahl: 3 Stühle, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
- Hinweis: Aufgrund der großen Kontaminationsgefahr kein primäres Untersuchungsgut (Ausnahme: Verdacht auf Darmtuberkulose oder bei
mit HI-Virus infizierten Patienten).
2.1.9 Blut
Nur nach Absprache mit dem Labor.
2.2 Durchführung der Untersuchung
2.2.1 Vorbehandlungsmethoden
Als Standardmethode gilt bei allen zur Untersuchung gelangenden Materialien die N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Methode. Die Vorbehandlung von sterilem Untersuchungsmaterial kann eventuell unterbleiben.
N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Methode:
- 2 g N-Acetyl-L-Cystein
- 5,88 g Trinatriumcitratdihydrat
- 200 ml Aqua destillata
- 200 ml NaOH (1 molar)
Bis zu 10 ml Probe mit dem gleichen Volumen N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Lösung in einem Zentrifugenröhrchen versetzen. Röhrchen verschließen und 20 min schütteln. Nach 20 min Röhrchen bis 1 cm unter dem Rand mit sterilem Aqua destillata auffüllen und bei 3500 x g
15-25 min zentrifugieren. Überstand verwerfen und das Sediment in 2 ml sterilem H2O resuspendieren.
- Hinweis: Alle Variationen dieser Methode können erfolgen. 1x pro Jahr sollte eine Validierung der Vorbehandlungsmethode durchgeführt werden.
2.2.2 Mikroskopie
Die Mikroskopie sollte grundsätzlich nach Vorbehandlung durchgeführt werden. Nicht erforderlich ist das routinemäßige Mikroskopieren von Stühlen (Ausnahme eventuell HIV-infizierte Patienten) und Harnen.
2.2.2.1 Auraminfärbung
Vorteil: schnelleres Mikroskopieren bei niedrigerer Spezifität
a) Präparat mit Auramin-Phenol-Gemisch bedecken
b) 10 min einwirken lassen
c) mit 0,4 % HCl-Alkohol differenzieren
d) mit Leitungswasser abschwemmen
e) mit konzentriertem Methylenblau (filtriert) gegenfärben
f) mit Leitungswasser abschwemmen
1 g Auramin auf 500 ml Aqua dest.
0,4% HCl-Alkohol:
4 ml Salzsäure (25%ig)
+ 996 ml Alkohol (96%ig)
Farbstofflösung (in dunkler Flasche) und Phenol im Brutschrank bei 37 °C aufheben.
2.2.2.2 Ziehl-Neelsen-Färbung
Vorteil: höhere Spezifität,
Nachteil: zeitaufwendiger (nur bei geringerer Probenzahl)
Heißfärbung
a) Hitze fixieren
b) Filterplättchen auflegen
c) Karbolfuchsin (konzentriert und filtriert) 3x bis zur Dampfbildung erwärmen
d) insgesamt 5 min einwirken lassen
e) mit Leitungswasser abspülen
f) mit 3 % HCl-Alkohol abspülen
g) mit 10%iger Methylenblaulösung 2 min gegenfärben
h) mit Leitungswasser abspülen
3% HCl-Alkohol:
2100 ml 96%-Alkohol
+ 900 ml Aqua dest.
+ 90 ml Salzsäure (25% ig)
Methylenblau:
10 ml konz. Methylenblau
+ 90 ml Aqua dest.
Kaltfärbung (z. B. modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung)
a) Hitze fixieren
b) Karbolfuchsin-Lösung (Tb-Color der Fa. MERCK) 5 min einwirken lassen
c) mit Leitungswasser abspülen
d) Entfärber-Lösung 15-30 sec einwirken lassen
e) mit Methylenblaulösung 1 min gegenfärben
f) mit Leitungswasser abspülen
Alle Variationen der Rezepte sind erlaubt, die Validierung der einzelnen Färbungen muss mittels Ringversuchen erfolgen.
- Hinweis: Umfärben positiver Auraminpräparate auf Ziehl-Neelsen bzw. Anfertigen von einem neuen Präparat.
2.2.3. Kulturmedien
Aufbringung der Proben erst nach Vorbehandlung mit NALC-NaOH.
Bei jedem Untersuchungsmaterial sollten mindestens drei Kulturmedien angelegt werden. Die Medien sollten so ausgewählt werden, dass der Einfluss der unterschiedlichen Zusammensetzung auf das Züchtungsergebnis ausgenutzt wird. Hier sind nach neuesten Erkenntnissen auf jeden Fall zumindest ein Flüssigkulturmedium und zwei unterschiedliche feste Medien zu wählen.
Die Bebrütung (36 °C +/- 1) der Festkulturen muss mindestens acht Wochen erfolgen, bei Flüssigkulturmedien in Geräten mindestens sechs Wochen, wobei 1 x/Woche eine Kontrolle auf Wachstum von Mykobakterien erfolgen muss.
2.2.3.1 Flüssigkulturmedium
z. B. Middlebrook 7H9, Dubos-Medium, BACTEC 12 B-Medium, MGIT, MB/BacT, Septi Check AFB System oder MB-Redox.
2.2.3.2 Festes Medium
z. B. Löwenstein-Jensen-Kulturmedium und deren Modifikationen, Eigelb-Kultur-Medium nach Gottsacker, Eierkulturmedium nach
Stonebrink, Coletsos, Middlebrook 7H10 und 7H11 (Medien gegebenfalls mit Antibiotikazusatz)
- Hinweis: Die Kulturröhrchen sind so zu verschließen, dass ein Gasaustausch möglich ist.
2.2.4 Molekularbiologische Verfahren
Diese stellen bereits heute eine wertvolle Ergänzung zu den bisher gängigen Nachweisverfahren dar. Sie sollten nur von Labors durchgeführt werden, die ausreichend Erfahrung mit der Kultivierung von Mykobakterien haben, damit auch die laufende Evaluierung der Methode sichergestellt ist.
2.3 Mindestanforderungen zur Identifizierung von Tuberkulosebakterien
Definition: Erreger der Tuberkulose der Arten Mycobacterium tuberculosis einschließlich geografischer Varianten (z.B. M. africanum) sowie M. bovis, die verwandten BCG-Stämme, M. microti und M. canetti.
Gemeinsame Merkmale: allen Tuberkulosebakterien gemeinsam ist
- ihre Säurefestigkeit,
- ihr langsames Wachstum auf modifizierten Löwenstein-Jensen-Kulturmedien (die Kolonien von Tuberkulosebakterien zeigen höchstens geringfügige Pigmentbildung),
- eine identische Signatursequenz im 16S rDNS-Genabschnitt.
Für die Differenzierung innerhalb der Tuberkulosebakterien sollten folgende Tests durchgeführt werden. M. microti und M. canetti werden bei der Differenzierung nicht besprochen (siehe Tabelle).
Tabelle: Häufigkeit des Vorkommens verschiedener Merkmale bei den verschiedenen Arten von Tuberkulosebakterien
a) Die Prozentangaben sind entnommen aus: Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, P.R. Murray (Herausgeber); American Society for Microbiology, ASM Press Washington D.C. (1995).
b) Die Prüfung der BSH/TCH-Empfindlichkeit bei INH-resistenten M.-bovis-Stämmen führt nicht zu bewertbaren Ergebnissen.
- Hinweis: Zur Speziesdifferenzierung als Mycobacterium tuberculosis reicht der Niacin-Test und die charakteristische Koloniemorphologie aus. Bei unklaren Ergebnissen Bestätigung durch die Nationale Referenzzentrale.
2.1.1 Sputum
ist das aus den tieferen Atemwegen spontan oder durch Provokation hervorgebrachte Sekret.
- Menge: soviel wie möglich, nicht mehr als 10 ml, kein Speichel, Morgensputum
- Anzahl: mindestens 3 Sputa, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
- Hinweis: Besonders das erste Sputum nach Gewinnung von Bronchialsekret oder Bronchoalveolärer Lavage erweist sich als besonders ergiebig.
2.1.2 Bronchialsekrete und Trachealsekrete
sind die instrumentell mit oder ohne Spülung gewonnenen Sekrete der tieferen Atemwege.
2.1.3 Magenspülwasser
ist der mittels einer Sonde beim nüchternen Patienten durch Spülung mit sterilem isotonem NaCl (0,9 %) gewonnene Mageninhalt (besonders geeignet bei Kindern und wenn kein Sputum möglich). Proben sofort nach Gewinnung mit konzentriertem Trinatriumphosphatpuffer (1-2 ml auf 50 ml) versetzen.
2.1.4 Morgenurin (Erststrahlharn)
ist der erste nach der Nachtruhe entleerte Urin.
- Menge: 30-100 ml
- Anzahl: mindestens 3 Harne, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
2.1.5 Gewebeproben, Abstriche, Punktate
sollen vor dem Verdunsten geschützt und in sterilen Gefäßen versandt werden. Ist bei Gefahr einer Austrocknung der Zusatz von Aqua destillata erforderlich, so muss dieses steril und im Volumen so gering wie möglich sein und darf keine bakterienhemmenden Zusätze enthalten.
- Hinweis: Bei Hautgewebeproben muss ein Kulturröhrchen bei 30 °C bebrütet werden.
- Menge: nach Rücksprache mit dem Labor
2.1.6 Menstrualblut
zweimalige Einsendung am 1. und 3. Tag der Menstruation, Abstrich oder Tampon, gleich nach Gewinnung in sterilem Aqua destillata auslaugen.
2.1.7 Liquor
- Menge: soviel wie möglich (nach Möglichkeit nicht weniger als 2 ml), Versand in sterilen Gefäßen
2.1.8 Stuhl
- Menge: 1 g (haselnussgroß)
- Anzahl: 3 Stühle, gewonnen an 3 aufeinander folgenden Tagen
- Hinweis: Aufgrund der großen Kontaminationsgefahr kein primäres Untersuchungsgut (Ausnahme: Verdacht auf Darmtuberkulose oder bei
mit HI-Virus infizierten Patienten).
2.1.9 Blut
Nur nach Absprache mit dem Labor.
2.2 Durchführung der Untersuchung
2.2.1 Vorbehandlungsmethoden
Als Standardmethode gilt bei allen zur Untersuchung gelangenden Materialien die N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Methode. Die Vorbehandlung von sterilem Untersuchungsmaterial kann eventuell unterbleiben.
N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Methode:
- 2 g N-Acetyl-L-Cystein
- 5,88 g Trinatriumcitratdihydrat
- 200 ml Aqua destillata
- 200 ml NaOH (1 molar)
Bis zu 10 ml Probe mit dem gleichen Volumen N-Acetyl-L-Cystein-NaOH-Lösung in einem Zentrifugenröhrchen versetzen. Röhrchen verschließen und 20 min schütteln. Nach 20 min Röhrchen bis 1 cm unter dem Rand mit sterilem Aqua destillata auffüllen und bei 3500 x g
15-25 min zentrifugieren. Überstand verwerfen und das Sediment in 2 ml sterilem H2O resuspendieren.
- Hinweis: Alle Variationen dieser Methode können erfolgen. 1x pro Jahr sollte eine Validierung der Vorbehandlungsmethode durchgeführt werden.
2.2.2 Mikroskopie
Die Mikroskopie sollte grundsätzlich nach Vorbehandlung durchgeführt werden. Nicht erforderlich ist das routinemäßige Mikroskopieren von Stühlen (Ausnahme eventuell HIV-infizierte Patienten) und Harnen.
2.2.2.1 Auraminfärbung
Vorteil: schnelleres Mikroskopieren bei niedrigerer Spezifität
a) Präparat mit Auramin-Phenol-Gemisch bedecken
b) 10 min einwirken lassen
c) mit 0,4 % HCl-Alkohol differenzieren
d) mit Leitungswasser abschwemmen
e) mit konzentriertem Methylenblau (filtriert) gegenfärben
f) mit Leitungswasser abschwemmen
1 g Auramin auf 500 ml Aqua dest.
0,4% HCl-Alkohol:
4 ml Salzsäure (25%ig)
+ 996 ml Alkohol (96%ig)
Farbstofflösung (in dunkler Flasche) und Phenol im Brutschrank bei 37 °C aufheben.
2.2.2.2 Ziehl-Neelsen-Färbung
Vorteil: höhere Spezifität,
Nachteil: zeitaufwendiger (nur bei geringerer Probenzahl)
Heißfärbung
a) Hitze fixieren
b) Filterplättchen auflegen
c) Karbolfuchsin (konzentriert und filtriert) 3x bis zur Dampfbildung erwärmen
d) insgesamt 5 min einwirken lassen
e) mit Leitungswasser abspülen
f) mit 3 % HCl-Alkohol abspülen
g) mit 10%iger Methylenblaulösung 2 min gegenfärben
h) mit Leitungswasser abspülen
3% HCl-Alkohol:
2100 ml 96%-Alkohol
+ 900 ml Aqua dest.
+ 90 ml Salzsäure (25% ig)
Methylenblau:
10 ml konz. Methylenblau
+ 90 ml Aqua dest.
Kaltfärbung (z. B. modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung)
a) Hitze fixieren
b) Karbolfuchsin-Lösung (Tb-Color der Fa. MERCK) 5 min einwirken lassen
c) mit Leitungswasser abspülen
d) Entfärber-Lösung 15-30 sec einwirken lassen
e) mit Methylenblaulösung 1 min gegenfärben
f) mit Leitungswasser abspülen
Alle Variationen der Rezepte sind erlaubt, die Validierung der einzelnen Färbungen muss mittels Ringversuchen erfolgen.
- Hinweis: Umfärben positiver Auraminpräparate auf Ziehl-Neelsen bzw. Anfertigen von einem neuen Präparat.
2.2.3. Kulturmedien
Aufbringung der Proben erst nach Vorbehandlung mit NALC-NaOH.
Bei jedem Untersuchungsmaterial sollten mindestens drei Kulturmedien angelegt werden. Die Medien sollten so ausgewählt werden, dass der Einfluss der unterschiedlichen Zusammensetzung auf das Züchtungsergebnis ausgenutzt wird. Hier sind nach neuesten Erkenntnissen auf jeden Fall zumindest ein Flüssigkulturmedium und zwei unterschiedliche feste Medien zu wählen.
Die Bebrütung (36 °C +/- 1) der Festkulturen muss mindestens acht Wochen erfolgen, bei Flüssigkulturmedien in Geräten mindestens sechs Wochen, wobei 1 x/Woche eine Kontrolle auf Wachstum von Mykobakterien erfolgen muss.
2.2.3.1 Flüssigkulturmedium
z. B. Middlebrook 7H9, Dubos-Medium, BACTEC 12 B-Medium, MGIT, MB/BacT, Septi Check AFB System oder MB-Redox.
2.2.3.2 Festes Medium
z. B. Löwenstein-Jensen-Kulturmedium und deren Modifikationen, Eigelb-Kultur-Medium nach Gottsacker, Eierkulturmedium nach
Stonebrink, Coletsos, Middlebrook 7H10 und 7H11 (Medien gegebenfalls mit Antibiotikazusatz)
- Hinweis: Die Kulturröhrchen sind so zu verschließen, dass ein Gasaustausch möglich ist.
2.2.4 Molekularbiologische Verfahren
Diese stellen bereits heute eine wertvolle Ergänzung zu den bisher gängigen Nachweisverfahren dar. Sie sollten nur von Labors durchgeführt werden, die ausreichend Erfahrung mit der Kultivierung von Mykobakterien haben, damit auch die laufende Evaluierung der Methode sichergestellt ist.
2.3 Mindestanforderungen zur Identifizierung von Tuberkulosebakterien
Definition: Erreger der Tuberkulose der Arten Mycobacterium tuberculosis einschließlich geografischer Varianten (z.B. M. africanum) sowie M. bovis, die verwandten BCG-Stämme, M. microti und M. canetti.
Gemeinsame Merkmale: allen Tuberkulosebakterien gemeinsam ist
- ihre Säurefestigkeit,
- ihr langsames Wachstum auf modifizierten Löwenstein-Jensen-Kulturmedien (die Kolonien von Tuberkulosebakterien zeigen höchstens geringfügige Pigmentbildung),
- eine identische Signatursequenz im 16S rDNS-Genabschnitt.
Für die Differenzierung innerhalb der Tuberkulosebakterien sollten folgende Tests durchgeführt werden. M. microti und M. canetti werden bei der Differenzierung nicht besprochen (siehe Tabelle).
Tabelle: Häufigkeit des Vorkommens verschiedener Merkmale bei den verschiedenen Arten von Tuberkulosebakterien
Spezies | Niacin-Test a) | Nitrat- reduktase b) | O2-Bedarf im Lebek-Agar | Empfindlichkeit | ||
BSH/TCH | Pyrazinamid | Cycloserin | ||||
M. tuberculosis | 95 % | 97 % | + | - | + | + |
M. bovis | 4 % | 9 % | - | +b) | - | + |
BCG | (20 %) | - | + | + | - | - |
a) Die Prozentangaben sind entnommen aus: Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, P.R. Murray (Herausgeber); American Society for Microbiology, ASM Press Washington D.C. (1995).
b) Die Prüfung der BSH/TCH-Empfindlichkeit bei INH-resistenten M.-bovis-Stämmen führt nicht zu bewertbaren Ergebnissen.
- Hinweis: Zur Speziesdifferenzierung als Mycobacterium tuberculosis reicht der Niacin-Test und die charakteristische Koloniemorphologie aus. Bei unklaren Ergebnissen Bestätigung durch die Nationale Referenzzentrale.
Im Folgenden werden vier Indikationsgruppen genannt, innerhalb derer festgesetzt wird, welche Untersuchungstechnik eingesetzt werden sollte, um möglichst schnell zu einem sicheren Ergebnis zu kommen. Bei der Indikationsgruppe A und B wird zusätzlich noch zwischen den zu untersuchenden Materialtypen unterschieden.
Legende: x = Test ist indiziert, (x) = Test ist nur nach Rücksprache indiziert, – = Test ist nicht indiziert
| Indikationsgruppe/Materialtyp | Mikroskopischer Nachweis säurefester Stäbchen | Nachweis von Tb-Bakterien durch Nukleinsäure-Amplifikation | Kultur auf festen und flüssigen Nährböden | |
A | Tuberkulose klinisch / radiologisch /histologisch hochverdächtige Fälle von Blindtherapie | |||
| 1. Respirationstrakt | x | x | x | |
| 2. Urogenitaltrakt | (x) | x | x | |
| 3. Sonstige | x | x | x | |
B | Tuberkulose klinisch / radiologisch/histologisch differential-diagnostisch möglich | |||
| 1. Respirationstrakt | x | x | x | |
| 2. Urogenitaltrakt | – | (x) | x | |
| 3. Sonstige | x | (x) | x | |
C | Fälle, bei denen eine Tuberkulose möglich, aber nicht sehr wahrscheinlich ist | (x) | – | x |
D | Verlaufskontrolle bei unbehandelten Patienten | x | – | x |
Legende: x = Test ist indiziert, (x) = Test ist nur nach Rücksprache indiziert, – = Test ist nicht indiziert
