| Die Richtlinie "In-vitro Resistenztestung von Bakterien" wurde am 2. Dezember 1999 in Wien während des Workshops "Standardisierung und Qualitätssicherung in der mikrobiologischen Resistenztestung" erarbeitet. Stattgefunden hat die Veranstaltung im Allgemeinen Krankenhaus (AKH Wien) unter den Auspizien der Österreichischen Gesellschaft für Chemotherapie (Präsident: O. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Graninger). |
Die Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen von klinischen Bakterienisolaten ist eine der grundlegenden Funktionen eines klinisch-mikrobiologischen Labors. Aus der Sicht des behandelnden Klinikers sind die Resultate der Resistenzbestimmung zumindest ebenso wichtig wie die der Keimidentifikation. Durch die Spezialisierung der klinischen Medizin kommt es zu einem häufigen Austausch multimorbider Patienten. Ebenso ist es für das öffentliche Gesundheitswesen wichtig, Resistenzentwicklungen erfassen und beurteilen zu können. Daher sollte von Seiten des mikrobiologischen Laboratoriums eine Priorität auf reproduzierbare und mit anderen Laboratorien vergleichbare Resistenztestung gelegt werden. Der Kliniker sollte die Befunde leicht interpretieren können.
Bereits seit Jahren bestehen von Seiten verschiedener Institutionen in den USA und in Europa Richtlinien oder Empfehlungen zur Resistenzbestimmung, die teilweise recht ähnlich sind (Tabelle 1 ). Das Problem liegt darin, dass die Grenzwerte bezüglich der Antibiotika-Resistenz
nicht direkt vergleichbar sind. Die ausführlichsten Richtlinien werden vom National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) herausgegeben.
Allerdings werden in diesen Richtlinien nur Antibiotika, die für den US-amerikanischen Markt zugelassen sind, berücksichtigt, was gewissen österreichischen Gegebenheiten nicht gerecht wird. Die Inkraftsetzung von europäischen Richtlinien ist in den nächsten Jahren nicht realistisch. Die Teilnehmer des Workshops "Standardisierung und Qualitätssicherung in der mikrobiologischen Resistenztestung" haben am 2. Dezember 1999 einstimmig beschlossen die Testung entsprechend NCCLS-Richtlinien durchzuführen. Die klinisch-mikrobiologischen Labors in Österreich verwenden somit ab dem Jahr 2000 NCCLS als österreichischen Standard.
Bei der Auswahl der zu testenden Antibiotika sollen die Empfehlungen der Österreichischen Gesellschaft für Chemotherapie (Formblatt 022) in der jeweils gültigen Fassung berücksichtigt werden.
| Referenzmethode | Land | Gesellschaft | Medium | Bemerkungen |
| NCCLS-Standard | USA | National Committee for Clinical laboratory Standards | Mueller-Hinton | |
| DIN | Deutschland | Deutsches Institut für Normung | Mueller-Hinton | |
| SFM | Frankreich | Société Française de Microbiologie | Mueller-Hinton | ähnlich NCCLS |
| Comparative | Großbritannien | British Society for Antimicrobial Chemotherapy | Iso-Sensitest | nicht auf MHK kalibriert |
| Stokes | Großbritannien | British Society for Antimicrobial Chemotherapy | Iso-Sensitest | nicht auf MHK kalibriert |
| SIR | Schweden | Swedish Medical Society | PDM-ASM | |
| WRG | Niederlande | Werkgroep Richtilijnen Gevoeligheidsbepaling en | Iso-Sensitest | |
| Neo-Sensitabs | Dänemark | Mueller-Hinton | Tabletten anstelle Papierplättchen, größere Durchmesser | |
| Calibrated dichotomous sensitivity | Australien | Sensitest | Dichotom; Plättchen- |
Das Hauptziel der Resistenztestung sollte eine Voraussage des Behandlungserfolges mit Antibiotika sein. Der Befund "empfindlich" impliziert eine hohe Wahrscheinlichkeit des klinischen Ansprechens auf ein bestimmtes Antibiotikum. Das Ergebnis "resistent" impliziert, daß eine Behandlung mit diesem Antibiotikum wahrscheinlich versagen wird. Die meisten Methoden haben auch die Kategorie "intermediär". Ein Resistenzbefund muss auch alternative antibiotische Substanzen angeben, weil ein Patient unter Nebenwirkungen leiden oder eine Unverträglichkeit auf das gegebene Antibiotikum entwickeln kann.
Prinzipiell sollte das klinisch-mikrobiologische Labor Resistenztestungen für Mikroorganismen, für die standardisierte Methoden zur Resistenzbestimmung vorhanden sind und die als pathogen zu werten sind, durchführen. Resistenztestungen von normaler bakterieller Flora und kolonisierenden Mikroorganismen sind nicht sinnvoll. Am besten sind die Routine-Resistenzbestimmungen für die häufigsten Erreger und die am
meisten eingesetzten Antibiotika standardisiert. Für seltene Erreger oder z. B. topisch verabreichte Antibiotika gibt es oft keine standardisierten Methoden, sodass unter Umständen eine Weiterleitung an ein Referenzlaboratorium zur MHK-Bestimmung erfolgen sollte.
Prinzipiell sollte das klinisch-mikrobiologische Labor Resistenztestungen für Mikroorganismen, für die standardisierte Methoden zur Resistenzbestimmung vorhanden sind und die als pathogen zu werten sind, durchführen. Resistenztestungen von normaler bakterieller Flora und kolonisierenden Mikroorganismen sind nicht sinnvoll. Am besten sind die Routine-Resistenzbestimmungen für die häufigsten Erreger und die am
meisten eingesetzten Antibiotika standardisiert. Für seltene Erreger oder z. B. topisch verabreichte Antibiotika gibt es oft keine standardisierten Methoden, sodass unter Umständen eine Weiterleitung an ein Referenzlaboratorium zur MHK-Bestimmung erfolgen sollte.
Die Durchführung der Methoden sollte entsprechend NCCLS-Richtlinien erfolgen.
1. MHK-Bestimmung im Dilutionsverfahren
Referenzmethoden (NCCLS); Resultat als MHK in µg/ml oder mg/L; Interpretation entsprechend den Empfindlichkeitskategorien der entprechenden Richtlinien. In dieser Diskussionsgrundlage soll auf die Dilutionsmethoden nicht allzu genau eingegangen werden, weil die Resistenzbestimmungen in der klinischen Routine meistens auf Agardiffusionsmethoden beruhen.
a) Bouillon-Makrodilutionsmethode
- Vorteile:
Anwendung in der Forschung (neue Antibiotika), MBK-Bestimmung möglich
- Nachteile:
arbeitsaufwendig
b) Bouillon-Mikrodilutionsmethode:
- Vorteile:
vorbereitete Platten für die Resistenztestung ev. kommerziell erhältlich, automatisierte oder semiautomatisierte Inokulations- und Ablesesysteme
- Nachteile:
teuer, wenn kommerziell erhältlich, eingeschränkte Flexibilität hinsichtlich der zu testenden Antibiotika
c) Agar-Dilutionsmethode:
- Vorteile:
leichtes Erkennen von Kontaminationen
- Nachteile:
zeitaufwendig, inbesondere wenn viele verschiedene Antibiotika getestet werden sollen
2. Agardiffusionsmethode
Der Plättchen-Diffusionstest wurde primär für schnell wachsende Bakterien entwickelt. Durch bestimmte Modifikationen kann er auch zur Resistenzbestimmung bei "anspruchsvollen" Organismen verwendet werden. Der Inhibitionsdurchmesser ist invers proportional der MHK.
Plättchen:
Die Beladung eines Filterpapierplättchens ist standardisiert, und wird üblicherweise bei der Entwicklung eines Antibiotikums festgelegt. Üblicherweise werden kommerziell erhältliche Plättchen benutzt, wobei die Lagerungsbedingungen und das Ablaufdatum zu beachten sind.
Agar-Medium:
Von NCCLS wird Mueller-Hinton-Medium empfohlen, weil dieses geringe Chargen-Varianz hat und nur geringe Sulfonamid-Trimethoprim- sowie Tetrazyklin-lnhibitoren beeinhaltet. Anspruchsvolle Mikroorganismen wie Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae und Streptokokken müssen auf anderen Medien getestet werden. Verschiedene Komponenten oder Zusätze können die Resistenztestungs-Resultate beeinflussen. Daher müssen jedenfalls entsprechende Qualitätskontrollen durchgeführt werden.
Inokulum:
ähnlich wie bei der Agar-Dilutionsmethode; für die Endkonzentration von 10 4 CFU 4-5 Kolonien in 4-5 ml entsprechender Bouillon, Inkubation bei 35 °C bis Trübung, anschließend Verdünnung, bis die Trübung einen McFarland-Standard von 0.5 entspricht.
Alternativ: Einbringen in 0.9%-NaCl-Lösung oder Puffer mit anschließender spectrophotometrischer Trübungskontrolle.
Test-Plättchen:
Das Auflegen der Testplättchen sollte jedenfalls nicht später als 15 Minuten nach der Beimpfung erfolgen (max. 12 Plättchen pro 150-mm-Platte; max. 8 Plättchen pro 100 mm Platte).
Inkubation:
35 °C bei Raumluft; manche Wirkstoffe werden durch eine erhöhte CO2-Konzentration verändert, daher wurden die Hemmhof-Durchmesser für CO2-Bebrütung entsprechend modifiziert.
- Vorteile:
einfach, reproduzierbar, billig, keine spezielle Ausrüstung erforderlich, für den Kliniker leicht verständlich, flexibel
- Nachteile:
Es gibt keine Standardisierung für jene Bakterien, die besondere Inkubationsbedingungen oder Medien erfordern. Nur ein qualitatives Ergebnis, wobei bei manchen klinischen Fragestellungen (Endocarditis, Bakteriämie, Osteomyelitis etc.) quantitative Ergebnisse (MHK) erforderlich wären. Probleme bei der Detektion von MRSA und VRE.
3. Gradient-Diffusionsmethode (Epsilon-Test)
Im Epsilon-Test (E-Test, AB-Biodisk, Schweden) diffundiert ein vorfabrizierter Antibiotika-Gradient von einem Kunststoffstreifen in ein Agar-Medium und ermöglicht so eine quantitative Resistenzbestimmung. Nährboden und Inokulum werden von der Firma vorgeschrieben. In zahlreichen Publikationen wird eine gute Korrelation zwischen den MHK-Ergebnissen im Dilutionstest und den E-Test-Ergebnissen beschrieben.
- Vorteile:
quantitativ (MHK), flexibel, einfach
- Nachteile:
teuer
4. Automatisierte Verfahren (z. B.)
Mini-Api
ATB
VITEK (BioMerieux)
WalkAWAY (Dade-Behring)
Phoenix (Becton Dickinson)
1. MHK-Bestimmung im Dilutionsverfahren
Referenzmethoden (NCCLS); Resultat als MHK in µg/ml oder mg/L; Interpretation entsprechend den Empfindlichkeitskategorien der entprechenden Richtlinien. In dieser Diskussionsgrundlage soll auf die Dilutionsmethoden nicht allzu genau eingegangen werden, weil die Resistenzbestimmungen in der klinischen Routine meistens auf Agardiffusionsmethoden beruhen.
a) Bouillon-Makrodilutionsmethode
- Vorteile:
Anwendung in der Forschung (neue Antibiotika), MBK-Bestimmung möglich
- Nachteile:
arbeitsaufwendig
b) Bouillon-Mikrodilutionsmethode:
- Vorteile:
vorbereitete Platten für die Resistenztestung ev. kommerziell erhältlich, automatisierte oder semiautomatisierte Inokulations- und Ablesesysteme
- Nachteile:
teuer, wenn kommerziell erhältlich, eingeschränkte Flexibilität hinsichtlich der zu testenden Antibiotika
c) Agar-Dilutionsmethode:
- Vorteile:
leichtes Erkennen von Kontaminationen
- Nachteile:
zeitaufwendig, inbesondere wenn viele verschiedene Antibiotika getestet werden sollen
2. Agardiffusionsmethode
Der Plättchen-Diffusionstest wurde primär für schnell wachsende Bakterien entwickelt. Durch bestimmte Modifikationen kann er auch zur Resistenzbestimmung bei "anspruchsvollen" Organismen verwendet werden. Der Inhibitionsdurchmesser ist invers proportional der MHK.
Plättchen:
Die Beladung eines Filterpapierplättchens ist standardisiert, und wird üblicherweise bei der Entwicklung eines Antibiotikums festgelegt. Üblicherweise werden kommerziell erhältliche Plättchen benutzt, wobei die Lagerungsbedingungen und das Ablaufdatum zu beachten sind.
Agar-Medium:
Von NCCLS wird Mueller-Hinton-Medium empfohlen, weil dieses geringe Chargen-Varianz hat und nur geringe Sulfonamid-Trimethoprim- sowie Tetrazyklin-lnhibitoren beeinhaltet. Anspruchsvolle Mikroorganismen wie Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae und Streptokokken müssen auf anderen Medien getestet werden. Verschiedene Komponenten oder Zusätze können die Resistenztestungs-Resultate beeinflussen. Daher müssen jedenfalls entsprechende Qualitätskontrollen durchgeführt werden.
Inokulum:
ähnlich wie bei der Agar-Dilutionsmethode; für die Endkonzentration von 10 4 CFU 4-5 Kolonien in 4-5 ml entsprechender Bouillon, Inkubation bei 35 °C bis Trübung, anschließend Verdünnung, bis die Trübung einen McFarland-Standard von 0.5 entspricht.
Alternativ: Einbringen in 0.9%-NaCl-Lösung oder Puffer mit anschließender spectrophotometrischer Trübungskontrolle.
Test-Plättchen:
Das Auflegen der Testplättchen sollte jedenfalls nicht später als 15 Minuten nach der Beimpfung erfolgen (max. 12 Plättchen pro 150-mm-Platte; max. 8 Plättchen pro 100 mm Platte).
Inkubation:
35 °C bei Raumluft; manche Wirkstoffe werden durch eine erhöhte CO2-Konzentration verändert, daher wurden die Hemmhof-Durchmesser für CO2-Bebrütung entsprechend modifiziert.
- Vorteile:
einfach, reproduzierbar, billig, keine spezielle Ausrüstung erforderlich, für den Kliniker leicht verständlich, flexibel
- Nachteile:
Es gibt keine Standardisierung für jene Bakterien, die besondere Inkubationsbedingungen oder Medien erfordern. Nur ein qualitatives Ergebnis, wobei bei manchen klinischen Fragestellungen (Endocarditis, Bakteriämie, Osteomyelitis etc.) quantitative Ergebnisse (MHK) erforderlich wären. Probleme bei der Detektion von MRSA und VRE.
3. Gradient-Diffusionsmethode (Epsilon-Test)
Im Epsilon-Test (E-Test, AB-Biodisk, Schweden) diffundiert ein vorfabrizierter Antibiotika-Gradient von einem Kunststoffstreifen in ein Agar-Medium und ermöglicht so eine quantitative Resistenzbestimmung. Nährboden und Inokulum werden von der Firma vorgeschrieben. In zahlreichen Publikationen wird eine gute Korrelation zwischen den MHK-Ergebnissen im Dilutionstest und den E-Test-Ergebnissen beschrieben.
- Vorteile:
quantitativ (MHK), flexibel, einfach
- Nachteile:
teuer
4. Automatisierte Verfahren (z. B.)
Mini-Api
ATB
VITEK (BioMerieux)
WalkAWAY (Dade-Behring)
Phoenix (Becton Dickinson)
Beruht auf MHK-Bestimmungen an einer großen Anzahl von Bakterien während der Entwicklung eines Antibiotikum.
Für das Festlegen von Grenzwerten werden unter anderem herangezogen:
a) MHK-Verteilung: Aufschluss über neue Resistenzmechanismen
b) Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
Pharmakokinetik: Distribution, Akkumulation und Elimination eines Antibiotikums über die Zeit
Pharmakodynamik: Zeitverlauf der Antibiotikawirkung auf einen Mikroorganismus
c) Klinische Ansprechraten
d) Bakteriologische Ansprechraten
Für das Festlegen von Grenzwerten werden unter anderem herangezogen:
a) MHK-Verteilung: Aufschluss über neue Resistenzmechanismen
b) Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
Pharmakokinetik: Distribution, Akkumulation und Elimination eines Antibiotikums über die Zeit
Pharmakodynamik: Zeitverlauf der Antibiotikawirkung auf einen Mikroorganismus
c) Klinische Ansprechraten
d) Bakteriologische Ansprechraten
Die Empfehlungen der Österreichischen Gesellschaft für Chemotherapie (Formblatt 022) sollen in der jeweils gültigen Fassung berücksichtigt werden.
E. Presterl, A. M. Hirschl, Wien, Dez. 1999
E. Presterl, A. M. Hirschl, Wien, Dez. 1999
